孔京华，乐 薇，于 敏，段凤琪，耿 哲，刘诗诗，谭宋杰

(武汉工商学院 环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)

1 引言

绿原酸是一种非常重要的活性物质，现代科学对绿原酸的研究已经深入到食品、保健和日用化工等多个领域[1]。在卫生部《药品标准》中，明确指出170种具有抗菌消炎、清热解毒的中成药均含有绿原酸且为主要成分[2]；在食品行业，绿原酸具有抗氧化稳定性和增香、保色等作用[3]，可广泛应用于食品和果品保鲜；在日用化工行业现已有许多添加绿原酸的防晒护肤品[4]。

在绿原酸及其相关产品的研究及生产中，绿原酸的检测是极其重要的环节。目前绿原酸的检测方法多种多样，如分光光度法、薄层层析—紫外分光光度法[5]、高效液相色谱法等方法，上述方法所需使用到的仪器昂贵且检测所需耗材费用相对较高，对测定环境要求高且主要适合在实验室进行检测，不适于现场的快速检测。基于这些因素限制了对绿原酸的进一步研究。目前国内外都在不断探索绿原酸的提取和合成方法，其成果也非常显著，这就对绿原酸的检测手段和方法有了更高的要求。因此本研究提出一种新型绿原酸含量检测方法—微流控纸芯片法。

微流控纸芯片法是当前微全分析系统发展的热点，以纸张为制作材质的纸质微流控芯片(简称纸芯片)，是一种新型微尺度分析器件[6]。利用特定材质在纸上制作疏水边界，将被测流体限定在预设的亲水区域内，引导流体流入检测区与预加的反应剂进行接触反应。上述纸芯片有以下优点，分析速度极快，可在数秒或数十秒时间内自动完成测定、分离或其他更复杂的操作，分析和分离速度比常规宏观分析法快一到两个数量级；试样与试剂消耗量极少，这既降低了分析费用和贵重生物试样的消耗，也减少了环境污染，是绿色分析技术；便携且应用广泛[7]，由于将微通道网络结构和其他功能单元集成在一个几平方厘米的芯片上，因此易制成功能齐全的便携式仪器，用于各类现场分析。

数码成像比色法是基于数码设备上获得的颜色数值完成定量分析的一种新方法[8]。该方法利用数码相机、智能手机等采集设备记录与待测成分浓度直接相关的颜色并通过一定方式将颜色的深浅进行灰度值或RGB值等数值化进行表示[9]，具有简便快捷、可进行现场快速定量测定的优势。

因此本研究基于数码成像法的原理，制作绿原酸快速测定纸芯片[10，11]，并结合智能手机的数码成像功能[12]，开发的一种纸基微流控数码成像法，为绿原酸含量快速测定提供新的思路。

2 材料与方法

2.1 材料

三氯化铁(分析纯) 天津市双船化学试剂厂；绿原酸(标准品) 春秋制药公司 ；甲醇(分析纯) 天津市凯通化学试剂有限公司；石蜡(分析纯) 中国石油天然气股份有限公司；正庚烷(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂；金银花(当季) 毫州市国药中药材饮片有限公司；定性滤纸(中速) 杭州通用电气生物科技有限公司；所有实验用试剂均为国产分析纯。

2.2 仪器

40目筛 上虞市龙翔精密仪器厂；YP202N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；四两装中药材粉碎机浙江省瑞安市飞达药材器械厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司； 0.1～2.5 μL移液器BIOHIT(百得)实验室仪器有限公司；小米MI 9 SE智能手机小米科技有限责任公司；高效液相色谱仪 岛津公司。

2.3 试验方法

2.3.1 纸基微流控芯片的设计

疏水胶带法制备纸基微流控芯片是取一定长度宽胶带，在胶带两头用胶带固定在白色滤纸上，取一定大小的滤纸，用6 mm打孔器打孔获得圆形滤纸，取6 mm的圆型滤纸每隔5 mm粘贴于胶带上，以宽胶带为疏水基底[13]，获得阵列检测纸芯片(图1)。

图1 疏水胶带法纸基微流控芯片示意

2.3.2 纸芯片拍照取色

自制封闭式长方体白色泡沫拍摄箱(长：30.0 cm，宽：20.0 cm，高：23.7 cm，内铺有A4白纸，手机摄像头与纸芯片的位置距离为10 cm，光源与纸芯片的距离为3 cm)打开QQ软件截图功能，对所拍摄的照片进行RGB读数，为保证数据的准确性，将显色的滤纸平均分成四份。在四个区域分别读数，取平均值。将得到的数据输入EXCEL软件中，按照数学模型计算[14]。

2.3.3 纸基微流控芯片法测定绿原酸含量的条件优化

对于所制作的纸基微流控芯片进行以下测定条件的优化。

2.3.3.1 氯化铁溶液体积的影响

分别准确吸取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL4%三氯化铁溶液滴于纸芯片的亲水检测区，以滤纸为背景进行拍照及取色。

2.3.3.2 氯化铁溶液浓度的影响

分别吸取2 μL 2%、3%、4%、5%、6%的氯化铁溶液在滤纸亲水检测区，待其干后，在检测区上滴加40 mg/mL的绿原酸2.0 μL，同时吸取对应氯化铁溶液于滤纸亲水检测区，作为空白对照。以滤纸为背景进行拍照及取色。

2.3.3.3 绿原酸溶液点样体积的影响

分别吸取2.0 μL4%氯化铁溶液滴于纸芯片的每个亲水检测区，待其干(约30 s)后，于检测区依次准确滴加0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL的40 mg/mL的绿原酸溶液，于室温下反应5 min后，进行拍照及取色。

2.3.3.4 反应时间的影响

制作5个1×3的纸基微流控芯片，在胶带上粘贴6 mm圆3个，在其中的一个圆上用记号笔标注序号1。在余下两个圆滤纸上使用0～2.5 μL的移液枪，分别吸取4%氯化铁试剂2 μL，待其干后。一个圆上滴加40 mg/mL的绿原酸标准溶液2.0 μL，另外一个不滴加任何试剂。将制作好的试纸粘贴在玻璃板上，分别在常温下反应5、10、30、50、70 min后，以滤纸为背景进行拍照及取色[15]。

2.3.4 纸芯片法测定绿原酸含量的标准曲线建立

在长约15 cm的胶带上每间隔0.5 cm粘贴直径为6 mm的圆形滤纸一个，制备得到8×2的阵列检测纸芯片。在最佳反应时间、显色剂用量下，滴加配置好的不同浓度的绿原酸标准溶液，进行拍照及取色，分析其RGB值，代入建立的数学模型中，得到绿原酸含量的标准曲线。

2.3.5 金银花中绿原酸的含量测定

2.3.5.1 绿原酸提取液的制备

取10 g干金银花放入粉碎机中粉碎，过40目筛，提取，超声过滤后将滤液定容至50 mL容量瓶。即得到绿原酸粗提[16]。

2.3.5.2 HPLC法-标准曲线法

色谱条件：色谱柱：Hypersil gold C18 (4.6 mm × 250 mm，5μm)，流动相：乙腈∶0.4%磷酸水溶液(85∶15)；检测波长350 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30 ℃。精密量取2、4、6、8 mL 0.1 mg/mL绿原酸对照品溶液，用甲醇稀释至10 mL，摇匀后得到不同浓度的绿原酸对照品溶液。各选10 μL进样，以浓度为横坐标，峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线[17]。取提取的金银花中绿原酸粗提液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容。在相同色谱条件下，取10 μL进样，将测得的吸收峰面积代入回归方程计算其浓度，并计算金银花中绿原酸的质量百分比。

2.3.5.3 纸芯片法-标准加入法

制备3×9阵列纸基微流控芯片[18]，在各亲水检测区按顺序标注序号1-9。在1-9检测区分别滴加2 μL4%的三氯化铁溶液，在1-7号检测区滴加上述制备的10、20、30、40、50 mg/mL绿原酸标准溶液2 μL。在8号检测区滴加金银花的绿原酸粗提液2 μL，9号检测区作为空白对照，以滤纸为背景进行拍照及取色，平行实验3次。取3次实验的RGB平均值绘制标准曲线，计算绿原酸含量。

2.3.5.4 加标回收实验

取待测样品提取液1 mL至烧杯中，备用，在制作的3×9的纸基微流控芯片上滴加4%的三氯化铁2 μL，再分别准确加入 0.1～0.5 μL的 40 mg/mL的绿原酸标准溶液，按照已优化的实验条件进行显色拍照及取色，平行三次实验。

2.3.6 数据处理

按照回收率=(加标测定值-测定值)/加标量，计算本实验方法的回收率[19]。

3 结果与分析

3.1 显色条件的优化

3.1.1 氯化铁体积的影响

不同氯化铁体积对绿原酸检测体系显色的图片及RGB值如图2所示。在滤纸上可以看出，滴加0.5～1 μL时。黄颜色的三氯化铁没有完全覆盖滤纸，在1.5 μL时刚好覆盖，2、2.5 μL时完全覆盖，为了保证氯化铁在覆盖滤纸且微过量。故选择三氯化铁溶液的滴加体积为2 μL。

图2 氯化铁体积的影响

3.1.2 氯化铁浓度的影响

不同氯化铁浓度对绿原酸检测体系显色的RGB值的影响如图3所示。可知，随着FeCl3的浓度增加，RGB值呈现下降趋势。当氯化铁溶液浓度从4%开始R、G、B值趋于稳定。由于氯化铁溶液本身有颜色，过多的Fe3+存在RGB值减小，使灵敏度降低。综合考虑，后续实验选择4%的氯化铁溶液作为最佳反应浓度。

图3 氯化铁浓度的影响

3.1.3 绿原酸点样体积的影响

不同绿原酸点样体积下绿原酸检测体系显色的图片及RGB值如图4所示。从显色图上看，点样体积为1.5 μL时，刚好铺满整个检测区；从RGB值来看，点样体积为2 μL时，RGB值趋于稳定；点样体积大于2 μL时RGB值相对标准偏差较大，这是由于边界显色物质聚集使斑点显色不均匀，造成R、G、B值重现性下降。综合考虑，选择点样体积为2 μL。

图4 绿原酸点样体积的影响

3.1.4 反应时间的影响

在常温下不同反应时间显色图片的RGB值如图5所示。可以看出，该纸芯片反应4 min后R、G、B值趋于稳定，且在显色10 min内其RGB保持稳定。本实验选择显色时间为5 min。

图5 反应时间的影响

3.1.5 标准曲线方程的建立

表1 不同数学模型的拟合情况

3.2 金银花中绿原酸含量的测定

3.2.1 重复性实验

按2.3.5操作，分别采用HPLC法测定绿原酸含量，平行3次，并与纸芯片法平行测定3次的结果进行比较，如表2所示HPLC法和纸芯片法。可知，HPLC法和纸芯片法重复性较好，RSD均不超过3%。此外从绿原酸含量的平均值来看，两种测定方法的结果较接近，说明检测结果完全能够满足绿原酸的检测，且检测结果较为准确、满意。

表2 HPLC法和纸芯片法测定绿原酸含量的重复性实验结果

3.2.2 金银花的加标与回收

表3 金银花的加标回收

3.3 HPLC法与纸芯片法的比较

本文对HPLC法和纸芯片进行了比较，结果如表4所示。可知，HPLC法具有检测限更低、检测仪器较昂贵的特点，而纸芯片法线性范围更广、检测试剂体积极少、除智能手机外检测材料可自制、成本更低廉，因此在一些检测条件相对简陋的快速测定中，纸基微流控数码成像法更具优势。

表4 HPLC法与纸芯片法的比较

4 结论

本实验经过探究确定了三氯化铁与绿原酸反应的最优条件，研究得到了检测绿原酸的新方法。实验结果表明，在4%的氯化铁试剂与绿原酸在常温下就能发生反应，并且在5 min之内颜色完成显色反应，生成稳定的深绿色化合物，并且试纸颜色不会褪色[20]。之后用手机拍照后，对照片进行RGB值分析，通过建立的数学模型，即可得出待测液中绿原酸的浓度，且与HPLC法所测得的浓度相近。通过对金银花中提取的绿原酸进行测定并与HPLC法测定结果对比发现，纸基微流控芯片的测定结果与HPLC法测定结果基本一致，能够实现全定量测定绿原酸的浓度。综上所述，所建立的纸基微流控数码成像法快捷、价格低廉，检测要求低，可广泛应用于各种样品绿原酸含量的快速测定。