马青艳，林吉进，黄 蕾

［1.广东省人民医院（广东省医学科学院）广东省心血管病研究所心血管辅助诊断科，广州 510080；2.广东省人民医院（广东省医学科学院）广东省心血管病研究所心内科，广州510080］

Caveolin 3是细胞膜穴样内陷分子的锚定蛋白，具有心肌特异性，只在心脏和骨骼肌中表达［1］，在蛋白质信号传导中发挥着活性调节因子的作用。既往研究表明，caveolin 3 不仅参与心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心律失常等疾病的病理生理机制［2］，而且调控caveolin 3 功能或表达水平可能起到治疗相关心血管疾病的作用［3］。由KCNA5 基因编码的Kv1.5 钾电流，是心房的超速激活延迟整流钾电流（ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current，Ikur）。此电流只影响心房动作电位持续时间（APD）复极化过程，而未影响心室复极化，是目前研发心房颤动药物的新靶点［4］。近几年已报道，caveolin 3 蛋白与心肌钙离子通道存在相互作用并调控该通道蛋白的表达、转运及功能［5］；而caveolin 3 蛋白与Kv1.5 钾通道是否存在相互作用，目前还未见报道。因此，本研究采用酵母双杂交技术初步探索caveolin 3 蛋白与Kv1.5 钾通道是否存在相互作用，然后应用免疫荧光细胞分析和膜片钳技术，证实caveolin 3 在心肌细胞中与Kv1.5存在相互作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

脂质体2000（Lipofectamine 2000）购自Invitrogen 公司，pGBKT7 载体和人类心脏cDNA 文库（载体为pACT2）购买自Clontech 公司，膜片钳放大器为美国Axon 公司的Axopatch 200 B。

1.2 Caveolin 3 质粒的构建

利用合成的带有EcoR I 和BamH I 限制性内切酶位点的特异性引物（Forward：5′-CGGAATTCATGATGGCAGAAGAGCA-3′；reverse：5′-CGGGATCCTTAGCTGTAGGTGCCCACAGG-3′）进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），PCR 扩增caveolin 3 基因的N 端全长（caveolin 3-NT，aa 1-159）。应用EcoR I 和BamH I 限制性内切酶酶切PCR 产物和pGBKT7 载体（Clontech），通过凝胶回收纯化得到两端分别为EcoR I 和BamH I 限制性内切酶位点的线性pGBKT7 载体和PCR 产物，应用T4 连接酶将两者连接，从而构建了pGBKT7-caveolin 3-NT 诱饵质粒。……