程华怡，施 巍

(上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011)

脑胶质瘤是最常见的中枢系统原发肿瘤，我国脑胶质瘤患者约占颅内肿瘤患者的35%以上，年发病率为5～8人/10万人，在原发性脑肿瘤中处于较高水平[1].脑胶质瘤高发于40～55岁的中年人群，该群体是社会的中坚和家庭支柱，因此，给家庭和社会带来严重影响[2].尽管脑胶质瘤的发病率在全身性肿瘤中所占比例不高，但具有治疗难度大，复发、转移、致死率高的特点[3].目前，临床治疗脑胶质瘤以手术联合放化疗为主，但疗效并不理想[4].近年来，随着生命科学的快速发展，开始从基因和分子通路水平探讨肿瘤的发生、发展机制，应用靶向治疗、免疫治疗等手段改善肿瘤患者的预后水平[5].细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)是CCNE1编码的一种核蛋白，以循环式表达存在于细胞周期中并发挥重要的调控作用[6].相关研究[7]显示：肺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织和细胞中均存在Cyclin E1表达，并介导肿瘤细胞增殖、迁移和耐药性的产生.Cyclin E1高表达能够促进人脑胶质瘤细胞的增殖和迁移，但作用强度和分子机制仍未完全阐明.有研究[8]显示：人脑胶质瘤细胞中，Cyclin E1表达上调对细胞增殖、迁移能力的促进作用无统计学差异.但亦有研究[9]显示：Cyclin E1表达上调能够明显促进人脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力.PI3K/Akt信号通路在正常细胞和肿瘤细胞的增殖、迁移中均发挥重要作用[10]；有研究[11]发现：Cyclin D1可通过影响PI3K/Akt信号通路表达来调控脑胶质瘤细胞的增殖和迁移，但关于Cyclin E1表达对PI3K/Akt信号通路的影响仍未明确.本研究通过体外细胞转染技术上调人脑神经胶质瘤U251细胞中Cyclin E1表达，探讨其对细胞增殖、迁移的影响.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人脑神经胶质瘤U251细胞(通派(上海)生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM细胞培养基(广州嘉胜康生物科技有限公司)；pEGFP-Timp1-Cyclin E1人源基因质粒、pEGFP-Timp1空载体质粒(上海钦诚生物科技有限公司)；鼠抗人Cyclin E1单克隆抗体、兔抗人p-PI3K、p-Akt单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京信诺金达生物科技有限公司)；Trizol总RNA提取试剂盒、CCK-8试剂盒、SYBR Green PCR Kit(200)试剂盒(上海宇淳生物科技有限公司)；Transwell 趋化小室(北京优尼康生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养与转染

使用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养人脑神经胶质瘤U251细胞，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)传代，收集对数期细胞用于实验.将人脑神经胶质瘤U251细胞分为空白对照组、阴性对照组、Cyclin E1转染组，空白对照组U251细胞进行常规培养，阴性对照组U251细胞转染pEGFP-Timp1空载体质粒，Cyclin E1转染组U251细胞转染pEGFP-Timp1-Cyclin E1质粒，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育48 h后，在荧光显微镜下观察转染情况，激发片波长460～550 nm，发射片波长590 nm.

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力

将对数期U251细胞的密度调至1×106/mL，向96孔板中接种1 500个/孔细胞；设置5组，每组设置3个复孔，置入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育，继续培养96 h；并于12、24、48、72、96 h 5个时间点取出培养板，向相应分组的培养孔中加入10 μL CCK-8试剂；应用酶标仪测定490 nm处的吸光度值.

1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移能力

24孔板中放入孔径8 μm的Transwell 趋化小室，取对数期U251细胞，消化、重悬、计数后向Transwell 趋化小室加入6×105个细胞以及无血清的DMEM培养基300 μL；向下室中加入含血清的DMEM培养基500 μL，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育48 h；取出Transwell 趋化小室，多聚甲醛固定、结晶紫染色后，在光学显微镜视野下计数迁移细胞数.重复上述操作5次，取平均值.

1.2.4 RT-PCR检测Cyclin E1 mRNA表达情况

应用Trizol总RNA提取试剂盒收集3组U251细胞总RNA，反转录得到cDNA.应用SYBR Green PCR Kit(200)试剂盒测定Cyclin E1 mRNA水平，反应体系30 μL，操作按试剂盒说明书进行；反应条件：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 2 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共30个循环.引物序列由上海同进基因科技有限公司设计合成，Cyclin E1上游引物：5′-AAAGTCCCCTCTTTAAACCGC-3′；下游引物：5′-CTTGTAAC GGGTCGTGATGCC-3′；内参β-actin上游引物：5′-GCAACTGAGGCTGGAAGT GG-3′；下游引物：5′-CCATGTAGGTACTGTTGAAAC-3′.应用2-ΔΔCT法定量分析Cyclin E1 mRNA相对表达量.

1.2.5 Western blot检测Cyclin E1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达情况

应用RIPA裂解液提取3组U251细胞总蛋白，BCA法蛋白定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；将目标蛋白转膜至PVDF，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，滴加鼠抗人Cyclin E1单克隆抗体(1∶200稀释)，兔抗人p-PI3K单克隆抗体(1∶500稀释)，兔抗人p-Akt单克隆抗体(1∶500稀释)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；次日滴加HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)，室温静置2 h，增强化学发光法显色，暗室显影；应用Image J软件分析各条带灰度值.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 质粒转染人脑神经胶质瘤U251细胞株的鉴定

质粒转染48 h后，荧光显微镜下观察显示：阴性对照组和Cyclin E1转染组的人脑神经胶质瘤U251细胞质中均可见绿色荧光，空白对照组中无荧光.此结果说明pEGFP-Timp1空载体质粒、pEGFP-Timp1-Cyclin E1质粒转染U251细胞株构建成功，其中，pEGFP-Timp1-Cyclin E1质粒转染U251细胞株荧光强度明显强于pEGFP-Timp1空载体质粒.见图1.

2.2 各组U251细胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白表达水平

Cyclin E1 mRNA和蛋白表达水平在3组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)，其中，Cyclin E1转染组Cyclin E1 mRNA和蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 各组U251细胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白的表达水平

2.3 各组U251细胞增殖情况

应用酶标仪测定490 nm处的OD值，U251细胞培养12、24 h时，细胞增殖水平在3组间比较差异无统计学意义(P>0.05).培养48、72、96 h时，与阴性对照组和空白对照组比较，U251细胞增殖水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05).阴性对照组与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 各组U251细胞增殖情况Tab.2 U251 cell proliferation in each group

2.4 各组U251细胞迁移能力

Cyclin E1转染组的迁移细胞数为(528.05±51.83)个，明显多于阴性对照组(131.73±35.09)个、空白对照组(129.58±32.14)个，差异具有统计学意义(t=28.391、28.804，均P<0.01)，每组均设置5个平行对照.见图2.

2.5 Cyclin E1过表达对PI3K/Akt信号通路的影响

Western blot法检测蛋白表达水平结果显示：Cyclin E1转染组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；阴性对照组与空白对照组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05).见图3、表3.

表3 各组U251细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平Tab.3 p-PI3K and p-Akt protein expression levels in U251 cells of each group

3 讨 论

高级别脑胶质瘤细胞具有很强的增殖、迁移和侵袭能力，是患者死亡的主要原因[12].脑胶质瘤的治疗方法主要包括手术、放化疗、基因治疗等，其中，手术联合放化疗的方案虽然不断革新，但在延长患者生存时间方面作用还不够理想，因此，放化疗联合基因治疗已成为目前研究的热点[13].探讨人脑神经胶质瘤细胞增殖和迁移的分子调控机制，对研发新的基因治疗方案、提升疗效、降低患者死亡率具有重要意义.近年来的研究[14]发现：多种非编码RNA能够在转录水平调节基因表达，介导肿瘤细胞的增殖、分化和转移，促进肿瘤组织的血管生成，参与疾病的发生与发展.其中，Cyclin D1作为细胞周期正调控因子，具有促进乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌等恶性肿瘤的增殖、迁移能力[15].基于该作用靶点设计的治疗药物在临床实验中取得了较好的效果[16].Cyclin E1与Cyclin D1同属于细胞周期蛋白家族，但目前关于Cyclin E1表达对人脑神经胶质瘤细胞影响的研究仍较为少见.有研究[17]显示：Cyclin E1是非编码RNA转录后的主要调节因子，能够加速大鼠体内肿瘤的生长和转移，缩短生存时间.Cyclin E1能够与RNA结合蛋白相互作用，抑制经靶基因活化的应激颗粒生成，降低癌细胞对放疗和化疗的敏感性[18].

细胞周期调节机制异常会导致细胞周期紊乱，细胞的增殖速率与人体需求不一致[19].有研究[20]发现：在头颈部肿瘤、恶性皮肤肿瘤等组织中Cyclin E1蛋白表达明显升高，同时在肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中均发现Cyclin E1蛋白过度表达[21]，推测Cyclin E1与人脑神经胶质瘤细胞的增殖和迁移存在相关性.本实验通过pEGFP-Timp1-Cyclin E1质粒体外转染人脑神经胶质瘤U251细胞，上调细胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白表达水平，并探讨对细胞增殖、迁移能力以及PI3K/Akt信号通路的影响.结果显示：Cyclin E1表达上调能够明显增强人脑神经胶质瘤U251细胞的增殖和迁移能力，促进人脑胶质瘤的发生与发展.相关研究[22]显示：Cyclin E1能够与CDK相互结合，形成异二聚体，介导人体多种生理过程.结合本研究结果可推测，Cyclin E1可能作为一种原癌基因或癌相关基因参与人脑神经胶质瘤细胞周期调控.PI3K/Akt信号通路可被多种细胞毒素或刺激物激活，参与细胞生长、运动、糖原代谢等基本生理进程的调控.有研究[23]发现，PI3K/Akt信号通路异常会引发2型糖尿病、心血管疾病、恶性肿瘤等多种疾病.在恶性肿瘤中已发现两处能够增强PI3K内在激酶活性的突变，Akt的活化突变也有相关研究报道[24].由于Akt信号传导异常所致的人体疾病发生率很高，已成为目前研究的热点之一.本研究中Cyclin E1转染组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组，提示Cyclin E1表达上调可能是通过激活PI3K/Akt信号通路来促进人脑神经胶质瘤U251细胞的增殖和迁移，具体分子调控机制仍需进一步深入研究.