宁晨旭，张晓燕，苏晓娟，吕辰子，孟祥龙，张朔生

(山西中医药大学中药与食品工程学院，晋中 030619)

催奶灵散收录于2015版《中兽药典》。催奶灵散配方为王不留行、黄芪、皂角刺、当归、党参、川芎、漏芦、路路通。性状为灰色的粉末，气香、味甘。具有补气补血、开胃健脾、增进食欲、消食化积的功效。临床上主要用于治疗家畜奶产量低下、缺乳等病症[1]。其中王不留行活血通经下乳消肿功效最为明显，故而将其作为本方中君药；漏芦与路路通也具有一定的通经下乳的功效，从而作为本方的臣药；且黄芪与当归具有活血调经的功效，党参与川芎具有行气补气的功效，进而促进家畜气血流通，调经下乳。本研究将通草加入催奶灵散配方中，并对王不留行进行炒制。按照中兽医药理论，通草入胃经，通胃气上达而下乳汁，且味甘淡，可治疗家畜产后乳汁不畅或不下及乳房炎。而王不留行行血脉，通乳汁，为治疗产后乳汁不下的常用之品，王不留行经炒制后质地松泡，利于有效成分煎出且走散力较强，较王不留行生品更有利于下乳通淋。研究采用响应曲面法优选新催奶灵散的最佳制备工艺，对新催奶灵散进行薄层鉴别并通过HPLC法测定新催奶灵散中的阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸和藁本内酯的含量，对新催奶灵散的质量标准的建立进行升级，为中兽药产品开发奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 RIGOL L-3000型高效液相色谱仪、AX224ZH/E型电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)、万能高速粉碎机DE-200 g(巩义市予华仪器有限责任公司)、HHS-21-8型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、药典筛(浙江上虞市道墟张兴纱筛厂)、超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、BCD-200MCX型离心机(上海安亭科学仪器厂)、马尔文Zetasizer Nano S90型纳米粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)、紫外荧光检测仪(北京市六一仪器厂)、SX2-4-10 NP型箱式电阻炉(上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器有限公司)。CZB1002电子秤(诸暨市超泽街器设备有限公司)，电子天平(奥豪斯仪器有限公司制造)，万能高速粉碎机DE-200 g(巩义市予华仪器有限责任公司)，YR-PTB真空泵(上海亚荣生化仪器厂)，HH-6型电热恒温水浴锅(常州市荣华仪器制造有限公司)，UltiMate 3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，TGL-20B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。乙腈为色谱纯，水为纯水，甲醇为分析纯。

1.2 材料 炒王不留行(批号：180701)、黄芪(批号：20190401)、皂角刺(批号：180601)、当归(批号：180801)、党参(批号：190101)、川芎(批号：190101)、漏芦(批号：181101)、路路通(批号：180301)均购自山西和仁堂中药饮片有限责任公司，经山西中医药大学张朔生教授鉴定均为正品。按炒王不留行20 g；黄芪10 g；当归20 g；党参10 g；川芎20 g；漏芦5 g；路路通5 g；麦芽10 g；通草10 g进行组方。传统催奶灵散购自山西浩东同达生物科技有限公司(批号：20190713)。

阿魏酸(批号：17092501)，洋川芎内酯(批号：17121105)，藁本内酯(批号：18113001)，绿原酸(批号：18071907)均购自成都普菲德生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 新催奶灵散单因素试验

2.1.1 干燥温度的考察 称取药材5份，分别在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃下干燥8 h，万能高速粉碎机粉碎3 min，取样品粉末过2号筛，考察干燥温度对药材过筛率的影响。

2.1.2 干燥时间的考察 称取药材5份，分别在60 ℃干燥2、3、4、5、6 h万能高速粉碎机粉碎3 min，取样品粉末过2号筛，考察干燥时间对药材过筛率的影响。

2.1.3 粉碎时间的考察 称取药材5份，分别在60 ℃干燥8 h，万能高速粉碎机粉碎1、2、3、4、5 min，取样品粉末过2号筛，考察粉碎时间对药材过筛率的影响。

2.2 新催奶灵散响应曲面实验

2.2.1 响应曲面法设计及实验结果 依据Box-Benhnken实验设计原理[2]，基于单因素实验的结果，分三个水平，采用响应曲面法对制备工艺进行优化。以单因素优选的三个水平作为自变量，以新催奶灵散的过筛率为响应值，设计实验方案。

2.2.2 响应曲面分析[7]应用 Design-Expert.V8.0.6 软件对新催奶灵散微粉制备工艺实验数据进行分析，得到过筛率对干燥温度(A)、干燥时间(B)、粉碎时间(C)的二次多元回归模型方程。

2.3 新催奶灵散质量标准研究 依照2015版《中兽药典》对催奶灵散项下相关规定对新催奶灵散质量标准考察，主要涉及性状、薄层、显微鉴别。对所制备的催奶散进行质量标准升级，我们建立了基于高效液相色谱法的阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸以及藁本内酯四种化合物的含量测定方法。具体测定方法如下。

2.3.1 新催奶灵散薄层色谱鉴别

2.3.1.1 供试品溶液的制备 取本品5 g，加石油醚(60～90 ℃)45 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇定容至1 mL，作为供试品溶液。

2.3.1.2 对照品溶液的制备 取川芎对照药材0.2 g，加石油醚(60～90 ℃)15 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。

2.3.1.3 鉴别 照中兽药典薄层色谱法(附录0502)试验。吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365 m)下检视。

2.3.2 新催奶灵散含量测定[3-4]

2.3.2.1 色谱条件 色谱柱为 Tnature-C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，体积流量为 1 mL/min，柱温为 25 ℃。阿魏酸定量测定：以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～15 min，25～45%甲醇，15～30 min，45%甲醇；流速为1.0 mL/min；检测波长为320 nm；洋川芎内酯Ⅰ定量测定：以甲醇-0.1%磷酸水溶液(37∶63)为流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长为280 nm；绿原酸定量测定：以乙腈-0.1%磷酸水溶液(12∶88)为流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长为327 nm。藁本内酯含量测定：以乙腈-水(56∶44)为流动相；检测波长为280 nm；流速为1.0 mL/min。

2.3.2.2 对照品溶液的制备[5-6 ]分别精密称定阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸、藁本内酯各对照品，精密称定，加50%甲醇定容，分别制成含阿魏酸1.4 mg/mL、洋川芎内酯Ⅰ 0.55 mg/mL、绿原酸0.2 mg/mL、藁本内酯2.8 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2.3 供试品溶液的制备 精密称定催奶灵散粉末(过二号筛)11 g，加入250 mL 50%甲9醇，水浴回流3 h，冷却至室温，滤过，取续滤液蒸干，残渣加50%甲醇溶解，定容至5 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3.2.4 样品测定 分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定。

2.3.2.5 方法学考察[8-10 ]精密吸取各对照品与供试品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定，进行系统适应性试验和专属性试验；分别配制浓度为0.01031、0.0206、0.0413、0.0825、0.165 mg/mL的阿魏酸对照品溶液，测定，以各对照品浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，建立回归方程；于0、2、4、6、8 h测定同一份供试品溶液的稳定性；将同一对照品溶液重复进样6次，进行精密度实验；取同一份样品，分别平行制备6份并测定，进行重复性考察；精密量取供试品溶液3份，分别按指标成分含量的 80%、100%、120%精密加入一定量的对照品溶液，每个质量浓度平行测定3份，进行加样回收率考察。

2.3.2.6 新催奶灵散的含量测定 用供试品溶液制备的方法，分别制备三份供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，测定，即得。

3 结 果

3.1 新催奶灵散单因素实验

3.1.1 干燥温度对过筛率的影响 不同干燥温度对过筛率的影响结果见图1-A。可见过筛率在50 ℃、60 ℃、70 ℃的干燥温度下出现起伏，在60 ℃的干燥温度下出现最高值。基于此，选取50 ℃、60 ℃、70 ℃三个干燥温度点进行响应曲面实验，在此范围内，过筛率具有相对最优值。

3.1.2 干燥时间对过筛率的影响 不同干燥时间对过筛率的影响结果见图1-B。过筛率在2 h、4 h、6 h的干燥时间下出现起伏，在4 h的干燥温度下出现最高值。基于此，选取2 h、4 h、6 h三个干燥时间点进行响应曲面实验，在此范围内，过筛率具有相对最优值。

3.1.3 粉碎时间对过筛率的影响 不同粉碎时间对过筛率的影响结果见图1-C。过筛率在4 min、5 min、6 min的干燥时间下出现起伏，在5 min的粉碎时间下出现最高值。基于此，选取4 min、5 min、6 min三个粉碎时间点进行响应曲面实验，在此范围内，过筛率具有相对最优值。

注：A为干燥温度对催奶灵散的过筛率的影响；B分别为干燥时间对催奶灵散的过筛率的影响；C为粉碎时间对催奶灵散的过筛率的影响图1 单因素实验结果Fig 1 One-factor experimental results

3.2 新催奶灵散响应曲面实验

3.2.1 响应曲面设计结果 结合单因素实验结果，以干燥温度(A)、干燥时间(B)、粉碎时间(C)为3个考察因素，以过筛率为响应值，设计3因素3水平因素表。根据Box-Behnken的中心组合设计原理设计出3因素3水平共17组试验，方案及结果见表1。

表1 响应曲面实验方案及结果Tab 1 Response surface experimental scheme and results

3.2.2 方差分析结果 应用 Design-Expert.V8.0.6 软件对新催奶灵散制备工艺实验数据进行分析，得到过筛率对干燥温度(A)、干燥时间(B)、粉碎时间(C)的二次多元回归模型方程：过筛率=-391.50000+19.19500A-71.32500B+4.37500C+0.45000AB-0.35000AC+0.75000BC-0.15225A2+5.02500B2+1.52500C2，工艺回归模型分析结果见表2。新催奶灵散制备工艺的回归模型F=18.79，P<0.05，模型决定系数R2=0.9603，Radj2=0.9092，变异系数(CV)=4.21%，表明模型拟合较好，F失拟=2.20，P>0.05表明模型失拟度不显著，模型选择较为合适其中的A、B、C、A2、B2、C2是重要的模型项。失拟F值为2.20，说明失拟度不显著。信噪比为25.079。该模型可用于指导设计催奶灵散工艺设计。

表2 响应曲面分析结果Tab 2 Response surface experimental results

3.2.3 响应曲面分析结果 通过 3D 图，观察曲面的倾斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著。从图2可得，干燥时间与粉碎时间的交互作用明显。因此，以过筛率为指标，使干燥温度、干燥时间、粉碎时间在响应范围内，最后得到新催奶灵散的最佳制备工艺为干燥温度为70 ℃的药材，干燥时间为4 h，粉碎时间为6 min。根据实际情况来看，将最佳工艺确定为干燥温度为60 ℃，干燥时间为4 h，粉碎时间为5 min。

注：AB分别为干燥温度及干燥时间对催奶灵散的过筛率的影响(A为三维响应曲面图，B为等高线图)；CD分别为干燥温度及粉碎时间对催奶灵散的过筛率的影响(C为三维响应曲面图，D为等高线图)；EF分别为干燥时间及粉碎时间对催奶灵散的过筛率的影响(E为三维响应曲面图，F为等高线图)。图2 响应曲面分析结果Fig 2 Response surface experimental results

3.2.4 工艺验证 根据优选出的新催奶灵散最佳制备工艺平行制备3份，按照上述试验条件进行检测，得到过筛率分别为97%、94%、95%，其平均值为95%。

3.3 新催奶灵散质量标准研究结果

3.3.1 薄层分析结果 薄层色谱结果见图3，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显同颜色的斑点，表明本方法各点分离度好、专属性强、重复性和稳定性好。

3.3.2 新催奶灵散含量分析结果

3.3.2.1 阿魏酸含量测定结果 阿魏酸对照品与供试品HPLC图见图4。方法学考察得出阿魏酸的线性回归方程为y=0.0017x+0.0004，R2= 0.999，结果表明阿魏酸在0.0103125～0.165 mg/mL范围内呈良好的线性关系；精密度试验RSD=1.18 %，稳定性试验RSD=1.01 %，重复性实验RSD=0.97 %，加样回收率实验RSD为2.68%，表明本方法精密度、稳定性、重复性与加样回收率良好，可以用于阿魏酸含量的测定。

图4 阿魏酸对照品与供试品的HPLC图Fig 4 Chromatogram of Ferulic acid reference and test substances

由含量测定结果得，新催奶灵散中阿魏酸的含量为0.526034±0.002663 mg/g。

注：1、2、3、5、6、7为供试品；4为对照药材。图3 薄层色谱结果Fig 3 Thin-layer chromatography experimental results

3.3.2.2 洋川芎内酯Ⅰ含量测定结果 洋川芎内酯Ⅰ对照品与供试品的HPLC图见图5。方法学考察得出洋川芎内酯Ⅰ的线性回归方程为y=0.0007x+0.0016，R2=0.999，结果表明洋川芎内酯Ⅰ在0.00262～0.015729 mg/mL范围内呈良好的线性关系。精密度试验RSD=1.17 %，稳定性试验RSD=1.01%，重复性实验RSD=1.05%，表明本方法精密度、稳定性与重复性良好，可以用于洋川芎内酯Ⅰ含量的测定。

图5 洋川芎内酯Ⅰ对照品与供试品的HPLC图Fig 5 Chromatogram of Senkyunolide I reference and test substances

由含量测定结果得，新催奶灵散中洋川芎内酯Ⅰ的含量为0.25353±0.003044 mg/g。

3.3.2.3 绿原酸含量测定结果 绿原酸对照品与供试品的HPLC图见图6。方法学考察得出绿原酸的线性回归方程为y=0.0026x-0.0038，R2=0.9995，结果表明绿原酸在0.00154375～0.0247 mg/mL范围内呈良好的线性关系。精密度试验RSD=2.11%，稳定性试验RSD=1.04%，重复性实验RSD=1.44%，加样回收率RSD=0.04%，表明本方法精密度、稳定性、重复性与加样回收率良好，可以用于绿原酸含量的测定。

图6 绿原酸对照品与供试品的HPLC图Fig 6 Chromatogram of chlorogenic acid reference and test substances

由含量测定结果得，新催奶灵散中绿原酸的含量为0.23975±0.007947 mg/g。

3.3.2.4 藁本内酯含量测定结果 藁本内酯对照品与供试品的HPLC图见图7。方法学考察得出藁本内酯的线性回归方程为y=0.0286x+0.0411，R2=0.9998，结果表明藁本内酯在0.25～4 mg/mL范围内呈良好的线性关系。精密度试验RSD=0.30%，稳定性试验RSD=0.13%，重复性实验RSD=0.05%，表明本方法精密度、稳定性与重复性良好，可以用于藁本内酯含量的测定。

图7 藁本内酯对照品与供试品的HPLC图Fig 7 Chromatogram of Ligustilide reference and test substances

由含量测定结果得，新催奶灵散中藁本内酯的含量为15.41618±0.480228 mg/g。

4 讨论与结论

家畜乳房炎是家畜在临产之前或妊娠期间常见的一种多发性疾病。该疾病会导致家畜患部充血，灼热，肿胀甚至拒绝仔畜吸奶或乳腺闭塞，乳汁郁结，给生产带来较大损失。本研究依据中兽医药理论将通草加进新催奶灵散配方中，并对王不留行进行炒制。通草归胃经，通胃气上达而下乳汁，且味甘淡，具有通经下乳的功效。通草的加入更有助于治疗家畜乳房炎。炒王不留行作为本方中君药，活血通经下乳消肿功效最为明显。新催奶灵散促进家畜气血流通，调经下乳，针对家畜乳房炎有一定的疗效。本实验先通过单因素试验，以过筛率为评价指标，分别考察不同干燥温度，干燥时间以及粉碎时间对过筛率的影响，实验结果表明干燥温度为50～70 ℃、干燥时间为3～5 h、粉碎时间为4～6 min。实验采用Box-Behnken 中心组合设计[11]，相较正交设计法测得结果更加直观准确，采用非线性模型拟合，可信度较好，具有很好的预测性，从而优选新催奶灵散最佳制备工艺。

通过高效液相法[12]，以新催奶灵散中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸和藁本内酯含量为评价指标，与其对照品进行对比，可以得到本实验确定的方法简便，快速，准确可靠，灵敏度高，可用于新催奶灵散的含量测定，以确保该药的安全、合理使用。

实验通过响应曲面法优化新催奶灵散制备工艺，得出新催奶灵散得到新催奶灵散的最佳制备工艺为干燥温度为70 ℃的药材，干燥时间为4 h，粉碎时间为6 min。并通过高效液相色谱法分别对新催奶灵散中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸和藁本内酯进行含量测定，得出阿魏酸的含量0.526034±0.002663 mg/g；洋川芎内酯Ⅰ的含量0.25353±0.003044 mg/g；绿原酸的含量0.23975±0.007947 mg/g；藁本内酯的含量为15.41618±0.480228 mg/g，进而为新催奶灵散制备工艺及质量标准提供了新思路和新方法。