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泰地罗新注射液在猪体内的药代动力学及绝对生物利用度研究

2020-12-31宋婷婷瞿红颖耿智霞郭李珉魏占勇曹兴元

中国兽药杂志 2020年12期
关键词:工作液内标血浆

宋婷婷,刘 静,瞿红颖,贾 兴,耿智霞,郭李珉,刘 欣*,魏占勇,曹兴元

(1.河北远征药业有限公司/河北省兽药技术创新中心,石家庄 050041;2.中国农业大学,北京 100193)

泰地罗新(Tildipirosin)是一种新型十六元环动物专用的大环内酯类半合成抗生素,由英特威公司开发,而后被美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国上市销售[1]。它是泰乐菌素的衍生物,具有高效、广谱的抗菌活性,对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和副猪嗜血杆菌引起的猪呼吸道疾病及溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌引起的牛呼吸道疾病具有很好的疗效[2-4]。大环内酯类药物通过与原核生物的核糖体蛋白50S亚基结合从而抑制细菌蛋白质的合成而发挥抗菌作用。一般而言,大环内酯类药物不会与哺乳动物的核糖体结合,是一类相对较安全的兽用药物[5]。

国外多年的生产和临床应用表明,泰地罗新注射液在动物呼吸感染性疾病防治中具有广阔的应用前景[6-7]。本试验对泰地罗新注射液肌内注射和静脉注射给药后在猪体内的药代动力学特征及绝对生物利用度进行了研究,旨在为兽医临床安全使用该药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪:Acquity UPLC-TQD,美国Waters公司;TGL-15B型台式高速冷冻离心机:上海安亭公司;HMA-50A 涡旋混合器:天津恒奥公司。电子分析天平:MS105DU型,感量0.00001 g,Mettler Toledo;天平:JY5002 型,感量0.01 g,舜宇恒平。

1.2 药品与试剂 泰地罗新对照品:含量98.7%,河北远征禾木药业有限公司提供;泰地罗新-D10对照品:含量98.9%,购买自加拿大TRC公司;泰地罗新注射液:50 mL∶2 g,50 mL/瓶,河北远征禾木药业有限公司提供;乙腈、甲酸,均为色谱纯;由Milli-Q超纯水仪制取的超纯水,符合GB/T 6682一级用水规定。

1.3 试液的配制

1.3.1 泰地罗新标准储备液(1 mg/mL) 精密称取适量泰地罗新对照品,用甲醇溶解并稀释制成浓度为1 mg/mL的标准储备液,置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 泰地罗新标准工作液(10 μg/mL) 准确量取适量泰地罗新标准储备液,用甲醇溶解并稀释制成浓度为10 μg/mL的标准工作液,置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 泰地罗新-D10(内标)标准储备液 精密称取适量泰地罗新-D10对照品,用甲醇溶解并稀释制成浓度为500 μg/mL的标准储备液,置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.4 泰地罗新-D10(内标)标准工作液 准确量取适量泰地罗新-D10标准储备液,用甲醇溶解并稀释制成浓度为1 μg/mL的标准储备液,置-20 ℃冰箱中保存。

1.4 试验动物 16头健康状况良好的三元杂交猪,雌雄各半,3~4月龄,由北京畜牧总站试验猪场提供,入选时体重为20.0~25.0 kg。所有试验动物均被饲养在专用猪笼中,通过笼号进行标识,在入选当天被随机分配1~16的编号,其环境条件适宜猪的生活。按常规饲养,自由饮水和采食,每天定量给予颗粒饲料。试验前观察1周,动物饮食、行为和体温等临床表现正常,有异常的动物,应剔除试验。

1.5 方法

1.5.1 试验设计与试验方案 16头受试猪随机分成 A、B两组,每组8头,A 组动物的平均体重为23.64±4.85 kg,B 组动物的平均体重为24.09±4.99 kg。A组为肌内注射组,按照推荐剂量4 mg/kg BW给药,B组为静脉注射组,按照1/4推荐剂量1 mg/kg BW给药。根据给药前一天的体重称量结果计算受试制剂的给药量。

1.5.2 样品采集 在每个给药方式的不同时间点,从猪的前腔静脉丛采血5 mL置于一次性肝素钠真空采血管中。采血时间点如下:对于肌内注射给药组和静脉注射给药组,均于给药前及给药后0.083 h、0.167 h、0.333 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 采集血样,离心,分离血浆后于-20 ℃保存备用。

1.5.3 色谱条件 色谱柱:BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm);梯度洗脱;流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μL;流动相:A相为0.1%甲酸乙腈溶液,B相为0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

1.5.4 质谱条件 质谱仪:Waters XEVO TQD;离子源(ESI):电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);离子源温度:120 ℃;脱溶剂温度:350 ℃;毛细管电压:3.5 kV;脱溶剂气流速:800 L/h;Q1、Q3均为单位分辨率。泰地罗新及泰地罗新-D10MRM质谱检测参数见表2。

表2 泰地罗新和泰地罗新-D10质谱条件Tab 2 Mass spectrometry of tildipirosin and tildipirosin-D10

1.5.5 血浆样品的处理 从冰箱中取出猪血浆,常温解冻,摇匀后精密移取0.5 mL血浆,加入25 μL泰地罗新-D10内标工作液(1 μg/mL),涡动10 s。加入乙腈2 mL,涡动2 min,使用高速冷冻离心机在4 ℃条件下以8000 r/min离心10 min,取出上清液。将以上提取液在50 ℃水浴下氮吹至近干。用初始流动相 0.5 mL溶解残余物,涡旋混合,经0.2 μm滤膜过滤,待UPLC-MS/MS测定。

1.5.6 检测限和定量限 在空白样品中添加已知浓度的泰地罗新标准工作液,制成含泰地罗新不同浓度的加标试样进行测定,重复操作5次,以能达到信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为血浆中的检测限(LOD),以能达到信噪比S/N≥10时样品的最低浓度为血浆中的定量限(LOQ)。

1.5.7 标准曲线和线性范围 分别设置5个不同浓度的标准工作液,依次为5、20、100、200、500 ng/mL(内标浓度为50 ng/mL),依据设定浓度加入标准品,将所得泰地罗新峰面积与泰地罗新-D10峰面积的比值为纵坐标,以相应的泰地罗新浓度为横坐标绘制标准工作曲线,得到相应的曲线方程与相关系数。

1.5.8 准确度与精密度 在500 μL空白血浆中加入泰地罗新标准工作液,制成含泰地罗新浓度为5、20、200 ng/mL的含药血浆样品。按照“1.5.5”项下的血浆样品前处理方法进行处理,进样分析。每日3个不同浓度,每个浓度重复6次,持续3 d,以样品中药物峰面积与内标峰面积之比,求得低、中、高3个浓度的回收率,计算各组变异系数,验证方法的准确度与精密度。

1.5.9 稳定性 分别添加3个不同浓度5、20、200 ng/mL的泰地罗新标准品于血浆中混匀:对样品进行前处理检测,室温24 h后以同样的方法再次制备样品进行前处理检测,分析待测物在室温的稳定性;每个浓度分成3份,置-20 ℃冰箱中,反复冻融3次后,与新鲜制备的血浆样品同时检测,分析待测物在冻融过程中的稳定性;样品在进行前处理后,分别在0、8 h检测样品,分析前处理后待测物的稳定性;样品在进行前处理后,分别在0、21 d进行前处理检测,分析待测物在血浆中的稳定性。

1.5.10 基质效应 用流动相配制成浓度分别为低、高2个浓度(20、200 ng/mL)的标准工作液,作为基质效应考察的参照溶液,进行UPLC-MS/MS分析。取不同来源的空白血浆样品,按照“1.5.5”项下进行样品前处理,分别加入低、高2个浓度的标准溶液0.5 mL溶解氮吹后的残余物,涡旋混匀,过0.2 μm滤膜,作为空白基质标准溶液,进行UPLC-MS/MS分析。

基质效应计算公式为:

ME%= A基质标准溶液/A参照溶液×100%

1.5.11 数据处理与分析 采用药代动力学软件WinNonlin6.4处理药动学数据,进行非房室模型分析,求出各药代动力学参数T1/2﹑Tmax﹑Cmax﹑AUC0-t和AUC0-∞等,以血药浓度平均值对时间作药-时曲线图,并根据公式计算绝对生物利用度(FIM)。

FIM=(DoseIV/DoseIM)×(AUClastIM/AUClastIV)

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 检测限及定量限 经测定,本方法检测限(LOD)为2 ng/mL,定量限(LOQ)为5 ng/mL。

2.1.2 标准曲线和线性范围 结果显示,泰地罗新在5~500 ng/mL的浓度范围内线性关系良好,其线性方程Y=3.69137X+0.858636,r≥0.999。

2.1.3 回收率与精密度 对添加不同浓度泰地罗新的血浆样品重复测定6次,共3个批次,其测定结果及计算所得的回收率与精密度见表3。由表中数据可知:泰地罗新在5、20、200 ng/mL 3个添加浓度水平下的回收率均在82.00%~109.99%,回收率稳定,批内变异系数≤5%,批间变异系数≤10%,精密度良好。

表3 血浆中泰地罗新回收率和精密度考察试验结果(n=6)Tab 3 Recovery and precision test results of tildipirosin in plasma(n=6)

2.1.4 稳定性 样品室温放置24 h后进行前处理检测,与新鲜制备的样品相比,待测药物的响应值的变异系数均低于20%;样品反复冻融3次后,待测药物的响应值的变异系数均低于20%;待测药物在进行前处理后,分别在0、8 h检测样品,待测药物的响应值的变异系数低于20%;待测药物在进行前处理后,分别在0、21 d时待测药物的响应值的变异系数低于20%。以上稳定性验证结果均符合农业部第1247号公告的相关规定。

2.1.5 基质效应 经过试验测定,泰地罗新在血浆低、高2个浓度样品中检测的基质效应在92.24%~100.58% 之间(RSD<3.12%),故此分析方法的基质效应可以忽略不计。

2.2 药动学结果

2.2.1 血药浓度-时间曲线 猪肌内注射(4 mg/kg BW)和静脉注射(1 mg/kg BW)泰地罗新注射液后,不同时间测得的泰地罗新注射液对应的平均血药浓度-时间曲线见图1。由图1可知,泰地罗新在猪体内吸收迅速,在1 h内可达到最大血药浓度;肌内注射泰地罗新的Cmax﹑AUC要大于静脉注射泰地罗新。

图1 猪肌内注射和静脉注射泰地罗新注射液后的平均药-时曲线图Fig 1 The mean concentration-time curves after intramuscular injection and intravenous injection of Tildipirosin in pigs

2.2.2 主要药动学参数 血药浓度时间数据采用WinNonlin6.4 版药代参数计算软件进行非房室模型分析计算药动学主要参数,见表4、表5。

表4 猪肌内注射(4 mg/kg)泰地罗新注射液后泰地罗新的主要药动学参数(n=8)Tab 4 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intramuscular injection of Tildipirosin at the dose of 4 mg/kg body weight(n=8)

表5 猪静脉注射(1 mg/kg)泰地罗新注射液后泰地罗新的主要药动学参数(n=8)Tab 5 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intravenous injection of Tildipirosin at the dose of 1 mg/kg body weight(n=8)

2.3 绝对生物利用度结果 按照“1.5.11”项下公式计算泰地罗新注射液的绝对生物利用度,结果显示肌内注射泰地罗新注射液的绝对生物利用度为77.15%。

3 讨 论

3.1 方法学 本试验建立了猪血浆中泰地罗新UPLC-MS/MS检测方法,该方法中样品测定灵敏度与准确度均较高,各项指标都能够满足测定要求。本试验采用内标法进行标定,用泰地罗新-D10做内标物,能够更好的对目标物准确定量,这与廖远军[10]报道的用泰乐菌素做内标物不同。

3.2 泰地罗新药动学特征 泰地罗新注射液以4 mg/kg BW单剂量肌内注射于猪后,测得0~144 h泰地罗新的Tmax、Cmax、AUClast、T1/2λz、MRTlast分别为0.58±0.36 h、0.88±0.17 μg/mL、11.00±4.05 μg·h/mL、33.58±22.01 h、35.60±10.00 h。国外文献报道[8],猪按4 mg/kg BW单剂量肌内注射泰地罗新,Tmax为 23 min,Cmax为0.90 μg/mL,AUClast为11.01 μg·h/mL,与本研究结果基本一致。赵森等[9]等报道,藏香猪按4 mg/kg BW单剂量肌内注射泰地罗新,Tmax为0.45 h,Cmax为0.75 μg/mL,T1/2为120.51 h,AUC为22.22 μg·h/mL。廖远军[10]报道,猪按4 mg/kg BW单剂量肌内注射泰地罗新,Tmax为0.38 h,Cmax为0.97 μg/mL,T1/2为124.45 h,AUC为15.75 μg·h/mL。闫超群[11]等报道,猪按4 mg/kg BW单剂量肌内注射泰地罗新,Tmax为0.51 h,Cmax为0.87 μg/mL,T1/2为100.83 h,AUClast为19.70 μg·h/mL。与以上国内报道相比,其中Tmax、Cmax基本一致,但与赵森[9]和闫超群[11]等报道的T1/2、AUC有所差异,可能与动物品种有关。

泰地罗新注射液以1 mg/kg BW单剂量静脉注射于猪后,测得0~144 h泰地罗新的AUClast、T1/2λz、MRTlast、Vz、Cl分别为3.56±1.62 μg·h/mL、50.91±23.47 h、37.53±4.52 h、17.59±8.09 L/kg、0.31±0.14 L/(h·kg)。上述数据表明,泰地罗新静脉注射给药后消除缓慢,分布容积大、血浆清除率低。此外,本试验发现,在猪耳缘静脉给药后5 min,血浆药物浓度较低,明显低于给药后10 min的血药浓度(最高血药浓度),说明药物从耳缘静脉循环回心并进入体循环时存在一个短暂的延迟时间。

3.3 生物利用度 将肌内注射给药后药-时曲线下面积(AUClastIM)与静脉注射后药-时曲线下面积(AUClastIV)比较,肌内注射泰地罗新注射液的绝对生物利用度为77.15%,说明泰地罗新注射液肌内注射给药吸收较好。该制剂的绝对生物利用度比已报道的稍低,可能与动物品种及个体差异有关。

4 结 论

本研究观察到药-时曲线在12~48 h血浆中的药物浓度出现起伏波动,出现这种现象很有可能是由于大环内酯类药物主要经胆汁排泄,存在肝肠循环等特点,进而出现“双峰”。另外,个体间的差异也有可能出现此种现象。同时由于试验猪机体的差异,脂肪囤积不同,以及肝肠和肾功能不同及试验期间应激也可造成。

本研究阐明了泰地罗新注射液肌内注射和静脉注射后在猪体内的药代动力学特征及绝对生物利用度。试验结果证实,按照4 mg/kg BW的剂量对猪肌内注射泰地罗新,吸收程度较好,为新兽药审批和临床使用提供了新的实验数据。

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