刘雪松，朱庆贺，杨旭东，张 艳，陈 曦，王 爽，王观悦，穆永才，罗天瑶，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)俗称大肠杆菌，属于肠杆菌科、埃希氏菌属，一种兼性厌氧、两端钝圆、革兰氏阴性短杆菌，几乎是所有动物肠道内的常在菌。但随着研究的不断加深，发现了一些大肠杆菌是有致病性的[1]，可引起多种动物疾病。致病性大肠杆菌可以引起犊牛腹泻，这种病发病急且具有传染性，2～3日龄犊牛最易感染。本病又被称为牛白痢，一般在气温多变的冬末春初发病率较高[2]。致病性大肠杆菌携带的毒力因子种类较多，其致病性也来源于多种毒力因子的相互作用。目前确定致病性大肠杆菌毒力因子主要有黏菌素菌毛、肠毒素、LEE毒力岛、志贺毒素以及溶血素等。不同种致病性大肠杆菌所携带的毒力基因是不同的，因此可以通过PCR技术对致病性大肠杆菌进行分类。根据相关研究表明，产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)目前是导致犊牛腹泻最常见的致病性大肠杆菌。目前牛源性致病性大肠杆菌所携带的毒力基因包括K88、K99、F17以及F41等[3-4]。

2018年11月黑龙江省哈尔滨市某牛场犊牛出现腹泻症状。患病犊牛出现暴发性腹泻，已导致3头犊牛死亡。本试验从该牛场送检病死犊牛器官中分离细菌，并通过生化试验、16S rRNA基因序列测定、毒力基因测定等方法对该株细菌进行鉴定，通过药敏试验筛选出这株细菌的敏感药物，旨在为帮助该牛场治疗犊牛腹泻提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 无菌采集来自哈尔滨周边地区某牛场中死亡犊牛的病料，包括小肠、大肠、瘤胃、肝脏以及脾脏等。

1.1.2 试剂与仪器 伊红美蓝培养基、麦康凯培养基，北京奥博星生物技术有限公司生产。MH培养基，广州鸿泉生物科技有限公司生产。50×TAE，北京索莱宝科技有限公司生产。革兰氏染色液，郑州理利生物工程有限公司生产。药敏纸片、生化试验管，杭州滨和微生物试剂有限公司生产。Taq Master Mix、DNA Marker，大连Takara公司生产。DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司生产。Bio-Rad梯度PCR仪，伯乐生命医学产品有限公司生产。凝胶图像处理系统，青岛科易伟业生物有限公司生产。

1.1.3 试验动物 清洁级昆明雌鼠10只，40日龄，体重大致在22～25 g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 分别无菌取病死犊牛的小肠、大肠、瘤胃、肝脏以及脾脏接种于麦康凯和伊红美兰琼脂平板上，37 ℃条件下培养12 h，再挑取菌落形态特征明显的单菌落，划线传代培养，连续培养3代后挑取单菌落进行革兰氏染色，显微镜观察细菌形态。

1.2.2 生化试验鉴定 对分离出来的菌株进行相关生化试验，包括麦芽糖、甘露糖、VP、吲哚、尿素酶、乳糖、L鼠李糖、间肌醇以及葡萄糖。

1.2.3 分离菌株的PCR扩增和测序 根据相关文献[5]，合成大肠杆菌16S rRNA的通用引物。菌液为模板提取DNA，用细菌16S rRNA的通用引物，进行PCR扩增。引物序列如表1所示。

表1 16S rRNA通用引物序列Tab 1 16S rRNA universal primer sequence

1.2.4 毒力基因的测定 根据相关参考文献中的引物序列设计CS31A、K88、K99、F17以及F41等毒力基因引物[6-7]。已提取的细菌DNA为模板进行扩增。引物序列如表2所示。

表2 毒力基因引物序列Tab 2 Primer sequence of virulence genes

1.2.5 动物致病性试验 试验小鼠分为试验组和对照组，每组5只。试验小鼠在试验前适应环境一周。在试验前24 h禁食、禁水。根据相关文献[3]，将分离菌种进行培养，并对试验组小鼠进行腹腔注射。每只小鼠注射量为1.5×109CFU/只。对照组注射无菌生理盐水。

1.2.6 药敏试验 按照CLSI相关指导[8]进行药敏试验。将分离得到的菌株用MH肉汤进行培养，用麦氏比浊仪将细菌浓度调整到0.5麦氏单位。将调整好的菌液均匀涂抹于MH琼脂平板上。将药敏纸片均匀的放置在涂抹细菌的平板上，两纸片之间圆心的距离不少于24 mm，每个平板放置不超过5个纸片。质控菌株为ATCC25922。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与形态观察 分离出来的细菌在麦康凯培养基上呈现粉红色菌落。在伊红美兰琼脂培养基上菌落呈现黑色带金属光泽、边缘整齐、光滑湿润的菌落。挑取菌落进行革兰氏染色，通过镜检观察到阴性杆菌，多散在，两端稍钝圆(图1)。

图1 分离菌株镜检(10×100)Fig 1 Morphology of isolates in the microscope(10×100)

2.2 生化鉴定 生化鉴定结果如表3所示。分离出的细菌能发酵乳糖，发酵葡萄糖产酸产气，发酵麦芽糖、甘露醇。吲哚试验、鼠李糖试验为阳性，VP、尿素酶以及间肌醇试验为阴性。分离细菌的生化特性与大肠杆菌生化特性相一致。

表3 生化试验结果Tab 3 Results of biochemical test

2.3 PCR鉴定 分离菌株通过DNA提取试剂盒，提取出DNA模板。提取的DNA模板经合成16S rRNA通用引物进行扩增，凝胶电泳后，在1543 bp处获得明显的条带(图2)，复合预期大小。用胶回收试剂盒进行回收测序后，用NCBI的Blast功能进行比对，发现其与GenBank上已知的大肠杆菌16S rRNA序列同源性为98%～99%。结合生化试验与序列比对结果，确定该株分离菌株为大肠杆菌。

2.4 毒力基因鉴定 以分离出的细菌的DNA为模板，检测该株细菌是否具有K88、K99、F17、F41以及CS31A毒力基因。经过试验发现，该株细菌携带K99毒力基因，未检测到其他毒力基因，如图3所示，为产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)。

2.5 动物致病性试验 腹腔注射菌液的小鼠在注射完的6 h后，出现精神沉郁、颤栗等症状；8 h后，小鼠排稀便；24 h，小鼠全部死亡。对死亡小鼠进行剖检，发现小鼠腹水增多，胃扩张鼓气，肠道积液，肠系膜充血，病变情况如图4所示。无菌采集病死小鼠的器官接种于麦康凯以及伊红美蓝培养基上。发现分别长出了粉红色菌落和带有金属光泽的菌落。可以认为是腹腔注射的大肠杆菌导致了小鼠的死亡。对照组小鼠注射了生理盐水，身体状况良好，无死亡现象。

图4 小鼠病变情况Fig 4 Pathological changes in mice

2.6 药敏试验结果 药敏试验结果如表4所示。将药敏试验结果与CLSI相关文件[10]进行对比，发现这株大肠杆菌对氨苄西林、头孢曲松以及头孢噻肟敏感，对环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星以及四环素耐药，对庆大霉素和土霉素素处于中介状态。

表4 药敏试验结果Tab 4 Results of drug sensitivity

3 讨论与结论

引起犊牛腹泻的因素有很多，根据其发生的原因不同，大致可以分为消化不良性腹泻以及传染性腹泻。传染性腹泻包括细菌、病毒以及寄生虫性腹泻[9]。细菌性犊牛腹泻的病原菌很多，包括了大肠杆菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌等[10]。通过大量的试验证明，在细菌性的腹泻病中，致病性大肠杆菌引起的腹泻病居多[11]，给相关养殖业造成了巨大影响。根据毒力因子、致病机理以及流行病学特征可以将致病性大肠杆菌分为五类，为产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)以及肠粘附性大肠杆菌(EAEC)[12]。目前主要应用PCR技术对相关毒力基因进行检测，来对大肠杆菌进行分型。其中ETEC主要检测的毒力基因为K88、K99、F17及F41等，EPEC为bfpA基因，EHEC主要检测eaeA以及irp2基因[13-15]。通过检测致病性大肠杆菌所携带的毒力基因，可以迅速为大肠杆菌进行分型，了解其致病机理以及对其治疗方案提供科学依据。张震等研究发现，在黑龙江部分牛场致病性大肠杆菌毒力因子的调查与分析中，ETEC菌株的检出率占比为76.09%[6]。经过流行病学调查已经证明，ETEC是导致犊牛腹泻最常见的大肠杆菌，其致病性与毒力因子密切相关，其中就包括了黏附素性菌毛以及肠毒素。ETEC被证实在进入机体后会依靠菌毛定殖于小肠黏膜进行繁殖，并分泌肠毒素，干扰正常的代谢，引起腹泻等症状，严重者可造成死亡[16]。菌毛K99最早分离于腹泻的犊牛和羔羊，是ETEC常见的菌毛之一[17]。本次从病死犊牛的体内检出的致病性大肠杆菌携带的毒力基因为K99，属产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)。本次试验对分离出来的致病性大肠杆菌进行了分型，了解该株细菌的大体致病机理，为今后的治疗提供了一定的理论依据。

药敏试验可以为治疗某种病原菌造成疾病的临床用药提供依据。药敏试验结果显示，本次分离出来的致病性大肠杆菌对氨苄西林、头孢曲松以及头孢噻肟敏感，对恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星以及四环素展现出了耐药性，这可能与这些抗生素多年来的使用有关系。根据王宏、杨斯琴等对牛源致病性大肠杆菌耐药情况的研究[18-19]可以看出，细菌的耐药性问题逐渐呈现出来，多重耐药的情况逐渐加重。研究表明，牛源致病性大肠杆菌对恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、多西环素等抗生素展现出较为强烈的耐药性，一些菌株多重耐药性情况严重，少则为4重耐药，多则达到17重耐药[20]，这对以后具有多重耐药性细菌的治疗会带来许多阻碍。面对这种情况，许多专家提出了解决方案，如抗生素的轮流使用、联合用药以及通过PK/PD模型对药物的剂量以及给药间隔重新进行评定[21]等，其中通过PK/PD模型对现有以及正在研发的抗生素提供具有科学依据的给药剂方案被广泛使用[22]。PK/PD模型与其他模型以及软件的联用为今后抗生素的合理使用提供了一种新的方向。通过相应的药敏试验与PK/PD模型的联用会为减缓细菌耐药性的产生做出巨大贡献。

本试验从牛场病死犊牛体内中分离出了致病性大肠杆菌，通过毒力基因检测以及药敏试验确定了该株细菌的分型以及对何种抗生素敏感，为治疗这株细菌引起的犊牛腹泻提供合理的依据。与以往的细菌鉴定试验相比，本次试验测定了相关的毒力基因，从基因角度证明了该株大肠杆菌的致病性。

M. DL2000 Marker；1. 阳性对照1；2.阳性对照2；3. 分离菌株M. DL2000 Marker；1. Positive control 1；2. Positive control 2；3 Isolated bacteria图2 细菌16S rRNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig 2 Results of bacterial 16S rRNA agarosegel electrophoresis

M. DL2000 Marker; 1. 阳性对照1; 2. 阳性对照2; 3. 分离菌株M. DL2000 Marker; 1. Positive control 1;2.Positive control 2; 3. Isolated bacteria图3 K99基因 PCR 鉴定结果Fig 3 Identification of K99 gene by PCR