朱明媛，刘 静，李艳玲，董建伟，黄 韬，李 润

(唐山怡安生物工程有限公司，河北唐山 063020)

犬细小病毒病(Canine parvovirus disease，CPVD)是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一种急性高度接触性传染病，与病犬接触后100%感染，致死率高达70%[1]。该病既严重威胁家养宠物的健康，又对我国养犬业和野生动物保护业构成较大危害。犬细小病毒病目前没有特效药物，除依靠动物自身的免疫系统抵抗外，接种疫苗是预防犬细小病毒感染的最有效方法。活疫苗、灭活疫苗、弱毒疫苗均有报道能一定程度预防犬细小病毒病[2-4]，目前国内常用弱毒疫苗预防犬细小病毒病，但弱毒疫苗通常因母源抗体干扰发生免疫失败，接种后动物可长期排毒，存在毒力返强风险。犬细小灭活疫苗具备免疫原性而不具有致病性，接种后动物能产生免疫应答，达到保护作用，越来越受到科研工作者的青睐，但制备灭活疫苗对抗原的滴度要求很高，所以获得高产量、高质量的抗原是实现犬细小灭活疫苗产业化的基础。

目前国内报道的获得犬细小病毒的方法主要有转瓶法、鸡胚法，鲜见有利用生物反应器培养犬细小病毒的报道。传统培养工艺培养病毒普遍存在病毒滴度低、批间差大、劳动力成本高、易污染等问题[5-6]，因此找到一种新的培养犬细小病毒的方法颇为急切。本文利用微型生物反应器及NBS反应器摸索培养犬细小病毒YA-16-C66株最佳工艺，并将利用该工艺生产的抗原同传统的转瓶工艺产品做对比，以期为犬细小病毒的高产、高质培养提供一种新的可行方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 F81细胞，唐山怡安生物工程有限公司驯化、保藏；犬细小病毒YA-16-C66株，唐山怡安生物工程有限公司筛选、保藏。

1.1.2 主要溶液与试剂 199培养基，天信合生物科技有限公司；新生牛血清，武汉三利生物科技有限公司；β-丙内酯(BPL)，德国SERVA；MONTANIDE GEL 02，赛彼科(上海)特殊化学品有限公司。

1.1.3 载体 聚酯纤维纸片载体，上海楚怡生物科技有限公司。

1.1.4 仪器设备 微型转管生物反应器，杭州安普生物工程有限公司；CO2培养箱，三洋MCO-15AC；BioFlo 310型生物反应器(5L)，美国NBS生物工程公司；SBA生化分析仪，济南延和生物科技有限公司。

1.1.5 实验动物 比格犬，北京玛斯生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 F81细胞的最佳接种密度确定 利用微型生物反应器，内含0.6 g聚酯纤维纸片载体。培养条件为：37.0 ℃ 5%CO2培养箱，培养基为1%新生牛血清的199培养基，分别按照0.5×107/g、1.5×107/g、2.5×107/g密度接种细胞。每个密度平行设置9支。为了确保细胞增殖不受营养及代谢产物的影响，培养基每24 h更换一次，并测定残糖浓度。每24 h取一支转管，将载体用0.25%胰酶消化后计数，分析细胞密度与葡萄糖消耗之间的关系。

1.2.2 犬细小病毒YA-16-C66株最佳接种剂量确定 利用微型生物反应器，以1.5×107/g密度接种细胞，同时以不同感染复数(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接种病毒。每个接毒剂量平行设置9支，将微型反应器置于37 ℃ 5%CO2培养箱培养。接毒后每24 h完全换液，测定葡萄糖消耗和上清液的病毒含量TCID50，TCID50测定方法参照《中国兽药典》[7]。每24 h取一支转管，将载体用0.25%胰酶消化后计数，直到纸片载体上细胞几乎全部脱落时结束培养。结合病毒含量和细胞病变情况，确定犬细小病毒YA-16-C66株最佳接种剂量。

1.2.3 犬细小病毒YA-16-C66株生物反应器培养工艺优化 按照工艺流程，将150 g纸片载体装入5L NBS生物反应器中，经高压蒸汽灭菌后备用。将生长成良好致密单层的F81细胞制成悬液，以1.5×107/g密度接种，犬细小病毒YA-16-C66株用培养基稀释后，以感染复数0.05 MOI接种。培养基为含1%新生牛血清的199培养基，培养参数设置为37 ℃，pH7.2，溶氧50%，搅拌速度50 r/min，24 h后开启灌流。1#反应器温度维持在37.0 ℃；2#反应器培养温度在接种细胞48 h后降至35.0 ℃。24 h开始每天取样测定葡萄糖消耗，根据糖耗及细胞病变清情况调整灌流速度，使反应器内葡萄糖浓度控制在0.5 g/L以上。48 h开始收获并每天测定病毒含量TCID50，直到纸片载体上细胞几乎全部脱落时结束培养，测定总病毒含量TCID50。经过3批次验证，比较两种不同温度培养对犬细小病毒YA-16-C66株产毒质量的影响，确定利用F81细胞生产犬细小病毒YA-16-C66株的纸片载体培养工艺。

1.2.4 反应器与转瓶培养犬细小病毒YA-16-C66株工艺比较

1.2.4.1 纸片载体培养工艺 按照1.2.3确定的工艺，在5L生物反应器中连续培养3批病毒。当糖耗降低，纸片载体上细胞几乎全部脱落时结束培养，收获上清液，测定病毒含量TCID50。

1.2.4.2 转瓶培养工艺 将生长成致密单层的F81细胞消化成悬液，与稀释过的犬细小病毒YA-16-C66株同步接入3L转瓶，每批次使用10个3L转瓶。病毒接种剂量为0.05 MOI，培养温度为37 ℃，转瓶机转速设置为10 r/h。当细胞病变达到80%～90%(CPE)以上时，收获病毒液，测定病毒含量TCID50。

1.2.4.3 犬细小病毒YA-16-C66株HI效价测定将反应器与转瓶获得的犬细小病毒YA-16-C66株分别经浓缩、β-丙内酯灭活，加入10%比例的MONTANIDE GEL 02，依据浓缩液TCID50结果制成抗原含量为107.0TCID50/100μL、符合质量标准的犬细小病毒灭活疫苗，产品名称依据抗原生产批次依次命名为CPV-C1910-001、CPV-C1911-002、CPV-C1912-003。

将6～8周龄的犬细小病毒抗体阴性、健康的比格犬分为6组，每组7只。取5只按0、7日免疫程序免疫，每只1 mL/次，作免疫组；2只不免疫，作对照组。首免后28日采血，依据《兽医微生物学实验指导》[8]进行血清抗体效价测定。

2 结 果

2.1 F81细胞最佳接种密度 以不同密度接种，F81细胞最大密度差异较小，但达到最大密度的时间不同，如图1所示。按0.5×107/g接种时，细胞增长较慢，到168 h细胞达到最大量。按2.5×107/g接种细胞比按1.5×107/g接种细胞提前一天达到最大密度，但达到最大密度后糖耗下降较快。按1.5×107/g接种时，F81细胞在纸片载体上生长和糖耗关系如图2所示，细胞生长与糖耗呈正相关，培养120 h后，细胞从9.0×106增加到8.92×107，糖耗最大达到3.58 mg/mL。因此，确定F81细胞最佳接种密度为1.5×107/g。

图1 不同接种密度葡萄糖消耗曲线Fig 1 Glucose consumption curve of different inoculation densities

图2 初始接种密度为1.5×107/g时的糖耗与细胞总量关系Fig 2 The relationship between glucose consumption and cell density with the initial concentration densities was 1.5×107/g

2.2 犬细小病毒YA-16-C66株最佳接种剂量不同感染复数(MOIs：0.05、0.1、0.2、0.4)接毒对生物反应器中犬细小病毒YA-16-C66株扩增的影响如图3所示，按0.05 MOI与0.1 MOI接毒，病毒达最大增殖能力的时间分别为96 h和72 h，且维持时间较长；高于0.1 MOI接种病毒时，细胞病变过快，细胞维持时间短，导致最终病毒滴度下降较快。由图4、图5可知，犬细小病毒YA-16-C66株病毒含量与糖耗呈正相关，四种接毒剂量的收获液病毒含量均能达到106.0TCID50/100μL以上。综合考虑，确定犬细小病毒YA-16-C66株接毒剂量为0.05 MOI。

图3 按不同MOI接种病毒的糖耗曲线Fig 3 Glucose consumption curve of virus inoculation according to different MOI

图4 按0.05 MOI接种病毒时的糖耗与病毒含量关系Fig 4 The relationship between glucose consumption and lgTCID50 with the virus inoculated at 0.05 MOI

图5 按不同MOI接种时收获液的病毒含量Fig 5 The lgTCID50 in harvest fluid inoculated with different MOI

2.3 生物反应器培养工艺优化 两种温度不同时间收获液病毒含量TCID50结果如图6所示，1#反应器收获液病毒含量在72 h达到峰值，为107.7TCID50/100μL，但病毒含量下降较快，96 h降为106.8TCID50/100μL。2#反应器收获液病毒含量达到峰值的时间为96 h，且到120 h病毒含量仍能维持在107.4TCID50/100μL，温度适当降低能维持细胞较长存活时间，对总病毒含量的提升更有利。综合分析，确定犬细小病毒YA-16-C66株反应器培养工艺为：采用同步接毒法，培养基为含1%新生牛血清的199溶液，细胞接种密度为1.5×107/g，接毒剂量为0.05 MOI，在pH 7.2条件下，37.0 ℃培养48 h后降温到35.0 ℃继续培养72 h，且待细胞病变达到80%～90%时收获上清液。

图6 不同温度下犬细小病毒YA-16-C66株增值曲线Fig 6 Proliferation curve of YA-16-C66 strain of Canine Parvovirus at different temperatures

2.4 反应器与转瓶培养犬细小病毒YA-16-C66株工艺比较 3批次反应器与转瓶收获液病毒含量和总量结果如表1：接毒后反应器中细胞能维持4～5 d，收获液病毒含量在107.6～107.8TCID50/100μL之间，收获液体积约为10.5 L；转瓶系统能维持4 d，收获液产量约为3 L，收获液病毒含量在105.9～106.5TCID50/100μL之间。反应器比转瓶收获液病毒含量高1.1～1.9 lgTCID50/100μL；相同培养面积，反应器所得病毒总量是转瓶所得病毒总量的2.8～18.5倍。

表1 反应器与转瓶收获液病毒含量和产量Tab 1 The content and yield of virus in the reactor and the spinner harvester

2.5 犬细小病毒YA-16-C66株HI抗体效价测定 3批次反应器与转瓶工艺产品HI抗体效价结果如表2：所有试验犬只免疫28 d的血清凝集效价均≥1∶896，能达到有效保护，同时对照组犬只的血清HI效价均显示为1∶10，即无抗体产生。

表2 反应器与转瓶工艺产品HI抗体效价Tab 2 HI antibody titer of the reactor and spinner technology products

3 分析与讨论

3.1 F81细胞培养载体 对于贴壁细胞而言，传统的小型培养容器有培养瓶、细胞工厂、转瓶等，利用反应器培养贴壁细胞一般借助于微载体和纸片载体。相比于培养瓶和细胞工厂的静置培养，转瓶培养系统具有结构简单、技术成熟的特点，而且细胞接种在旋转的圆柱状瓶中，培养过程中转瓶不停旋转，使细胞交替接触营养液并进行空气交换，更有利于细胞生长。因为重复性好，放大只需要简单的增加转瓶数量，转瓶培养系统常用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞的一种途径。

纸片载体是顺应反应器大规模培养而发展起来的细胞培养载体，相对于转瓶培养系统，利用反应器进行纸片载体培养细胞具有节省劳动力、占地空间小，单位体积提供细胞生长的表面积大，细胞生长密度高，培养时能实时监测并控制环境条件等优点。纸片载体多层张力结构能保证培养基与细胞充分接触，培养基流过载体层，搅拌剪切力和通气气泡对细胞生长不产生影响，更有利于细胞生长[9]。在5L NBS反应器中，150 g纸片载体能提供细胞生长的表面积为2.25×105cm2，相当于150个3L转瓶提供的表面积，根据糖耗与细胞生长之间的关系，F81细胞在5L反应器中生长的最大量能达到3.02×1010/g，而具有同样生长面积的转瓶中F81细胞最多能达4.90×109，相差6倍。

3.2 F81细胞培养犬细小病毒工艺 利用转瓶培养病毒属于劳动密集型方法，需要众多人员，步骤繁琐，比较容易发生污染，而且转瓶单位体积产量较低，培养过程中环境差异及人员操作误差常导致不同批次毒价不稳定[10]。

利用生物反应器培养F81细胞，可根据细胞生长特性实时监测与调控温度、pH、溶氧等参数，细胞密度和活力高于转瓶或者固定的平面等培养系统。随着细胞灌流技术的发展，对于细胞培养与病毒生产条件不一致的工艺，降低培养温度，提高代谢所需物质，最终能有效提高病毒的产量与质量[11-12]。利用5L反应器与3L转瓶同时培养犬细小病毒YA-16-C66株，生物反应器收获液病毒含量均在107.0TCID50/100μL以上，而转瓶收获液病毒含量从105.9TCID50/100μL到106.5TCID50/100μL；相同培养面积，反应器所得病毒总量是转瓶所得病毒总量的2.8～18.5倍；相同抗原含量的灭活苗，反应器与转瓶工艺产品无显著性差异，血凝抑制效价均为1∶896。

4 结 语

本试验确定了NBS生物反应器培养F81细胞生产犬细小病毒YA-16-C66株的工艺，属于该毒株在NBS生物反应器中培养的初步探索。利用该工艺培养的犬细小病毒YA-16-C66株，抗原滴度达到107.8TCID50/100μL，工艺产品血凝抑制效价HI在1∶768以上，完全达到犬细小灭活苗制备的要求[13]，且比转瓶工艺抗原产量高，极大的节约了生产成本，为犬细小病毒YA-16-C66株的产业化提供了一种经济有效的方法。