范哲源，孙嘉阳，张云峰，胡高戬，刘泽平，王星星，吕佳音

(吉林大学中日联谊医院 骨关节与运动医学，吉林 长春130033)

运动系统功能的实现需要借助多种组织的协调活动，包括一些结缔组织，如连接骨与肌肉的肌腱和连接骨与骨之间的韧带[1-4]。复杂的结构决定了肌腱与韧带在人体进行活动时其受伤的概率大大增加。大部分前交叉韧带损伤集中在患者运动中的非接触性损伤，尤其是滑雪运动中[5-6]。目前关节镜下的前交叉韧带重建手术已被大多数临床医生视为该结构损伤的首选治疗方法[7]，在临床中取得了非常理想的疗效。但是腱骨愈合的不成熟导致腱骨界面仍是重建后复合体中最薄弱的部分[8]。这导致了骨隧道扩大、膝关节松弛、重建韧带失效等术后相关并发症的发生。类似的情况还包括肩袖、后交叉韧带、内侧副韧带等部位的损伤。研究者们发现多种生长因子(如转化生长因子-β、血管内皮生长因子、骨形态生成蛋白、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子等)、各种来源的间充质干细胞(如骨髓、脂肪、肌腱等)、各类可降解支架、体外低强度脉冲超声波等均可以对腱骨愈合产生积极的影响。机械刺激也是影响腱骨愈合的重要因素之一，但是具体的影响以及发生机制仍处于争议中。机械刺激在实际的临床工作中可以以康复锻炼的形式表现，尽快开始进行康复锻炼可以帮助患者提前恢复肌肉力量和本体感觉，并降低远期关节僵硬的发生。但是过早的康复锻炼又会使初期较为脆弱的腱骨界面发生微动，进而产生未知的生物学与组织学变化。本文对近些年有关机械刺激与腱骨愈合的相关文献进行综述，以期对临床治疗提供依据。

1 腱骨愈合的发生

1.1 天然腱骨结构

肌腱与骨骼之间的连接位点是一种复杂过渡区域。在以直接插入作为插入方式的组织，如前交叉韧带中，天然的腱骨过渡区是由肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨、骨骼的4个区域构成的[9]。在组织学的研究中可以发现这一变化是逐渐发生的，这一结构的刚性会随着胶原纤维的排列与逐渐发生的钙化而增加[10]。而非直接插入的组织，如内侧副韧带中，插入位点则由Sharpey纤维构成。这种纤维与肌腱与骨的长轴斜向固定以在两种组织之间起到锚定[10]。对于韧带损伤的手术处理目前大部分选择将肌腱与骨直接接触，早期利用瘢痕愈合提供腱骨界面的初始强度，远期依靠腱骨愈合以达到或接近健侧肢体的组织强度。

1.2 腱骨愈合过程

腱骨愈合的过程目前尚未完全明确。过程可能涉及括隧道内成骨、新生骨塑形、腱骨界面形成血供、Sharpey 纤维的形成及纤维软骨钙化等多个环节共同调节。最早的愈合阶段主要为炎症反应，主要由特定的巨噬细胞的亚群介导。手术后4天，从循环和中性粒细胞中募集的巨噬细胞出现在腱骨界面中，并且参与吞噬细胞碎片，募集额外的炎症细胞，并协助促进促炎细胞因子释放。在10天后，原本和后产生的巨噬细胞可以被区分出来。这些炎性细胞将产生多种细胞因子，如转化生长因子β(TGF-β)，这有助于形成骨隧道与移植物之间的纤维血管瘢痕组织界面。在术后前8周，肌腱骨界面发生免疫组织学变化，此时表面出现巨噬细胞与骨髓衍生的干细胞的浸润。最初，该界面主要含有Ⅲ型胶原蛋白，并产生血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等生长因子，刺激抗血管生成和成纤维细胞的生成。同时骨隧道开始了隧道壁的细胞骨化和软骨细胞生成，这一过程中减少了肉芽组织并产生了Ⅱ型胶原蛋白。肉芽组织逐渐被骨组织和软骨细胞替代。同时，隧道和移植物之间的剪切应力导致产生更多的夏普氏纤维，并从移植物的边缘表达FGF，吸引成纤维细胞进入移植物中并产生Ⅲ型胶原蛋白。在增殖阶段期间干细胞发生增殖和分化，新生骨骼慢慢成形，复合物强度也随之改善。随着肌腱移植物和骨骼之间胶原纤维的连续性、细胞性和血管性的降低，腱骨界面逐渐完成移植物的重塑。

2 不同手术模型对于腱骨愈合的不同响应

2.1 非骨隧道内模型

Hettrich等人构建了将小鼠髌腱离断后重新将其附着在天然足印区的动物模型[11]。术后对腱骨复合物施加机械负载，以施加负载的开始时机和负载强度作为因变量，分为固定组，立即负荷组，低负荷延迟4天组，低负荷延迟10天组，高负荷延迟4天组，高负荷延迟10天组。之后选择多个时间点将小鼠处死，进行组织学、免疫组化、影像学和生物力学等相关分析。最终结果提示术后固定可以形成机械强度更强，组织排列更好的腱骨界面，固定组在4、10、21天时具有更好的胶原纤维组织；在10、21、28天时有着更低的MMP-13的表达；所有时间点都较少的凋亡细胞；4和28天时更少的IL-1B。这些结果表明固定处理可以形成强度更高的腱骨复合物，改善了腱骨界面的结构和组成。Zhang等人研究显示出与上述相似的结果[12]。在使用单侧冈上肌肌腱离断后再修复的模型中，该实验分为术后立即随意活动组和7天后跑步机活动组。结果显示跑步机组在4周时在新生骨量与腱骨复合物强度的表现上均优于对照组，8周时2组之间的差异较小。随后研究者又进行了定量逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光染色实验，提示在肩袖损伤后修复的模型中，机械刺激可能通过增加降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)和外周神经肽Y(NPY)等的表达来促进腱骨愈合。Wada等人选择类似的小鼠冈上肌模型比较术后固定与术后负荷组，结果提示过度负荷可能由于影响了Ihh和 Wnt/β-Catenin通路的活化，导致腱骨界面强度下降[13]。以上的研究提示在肌腱直接附着在骨骼上的手术模型中早期较长时间的固定对于提高复合体的失效负荷，新生骨的体积等方面有积极意义。

2.2 骨隧道内手术模型

移植物在骨隧道内的愈合可能与其受力的方式有关。有人将雌性日本白兔的趾长伸肌腱的近端游离，然后将肌腱与胫骨长轴垂直方向穿过骨隧道，将动物于6、8、12、24周时处死再进行组织学分析。结果显示拉伸力可以增强腱骨界面的再生，压力可以促进纤维软骨的形成，而剪切力对于腱骨愈合似乎没有影响[14]。与之采用类似的方法对移植肌腱进行固定的另一组实验在实施过程中加入了间充质干细胞或新鲜骨髓，实验结果表明加入了新鲜骨髓的组别出现了生物力学强度更高，更多新鲜骨形成的腱骨界面[15]。这似乎与更多的M2巨噬细胞和更少的M1巨噬细胞表达有关。Rodeo等人则使用了忽略剪切力和压力，以拉伸力为主要研究的出发点，将小鼠分为固定组，低应力组与高应力组[16]，结果显示低应力组在3周时显示出更高的失效负载，但是这种生物力学上的优势在6周时不复存在，而固定组在3、6周时都表现出更高的骨体积分数。

前交叉韧带重建是最常应用的骨隧道手术模型[17-19]，所以更多的研究者选择了以前交叉韧带重建为模型的动物实验，以期寻找术后机械负载对于腱骨愈合的影响[20-22]。为了寻找不同等级的机械负载对腱骨愈合的影响，Ma等人对小鼠的前交叉韧带重建模型的股骨隧道进行调节，进而改变隧道内移植物的受力[22]。最终的结果显示固定化对于腱骨复合物的骨形成有积极的影响，而较低应力的刺激对于远期提升腱骨复合物强度有帮助，高应力刺激可能由于更多的破骨细胞表达从而延迟腱骨愈合。有研究者从康复的角度用兔子模型模拟人在前交叉韧带重建术后进行CPM锻炼。结果显示经历两周CPM训练的组别有着更多的纤维软骨生成，更多的胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、碱性磷酸酶、肌腱蛋白C等前体物质的表达，从而提升了腱骨复合物的强度，体外培养的结果与动物实验的结果相似，佐证了机械刺激对骨髓间充质干细胞与肌腱细胞的影响。当以术后开始进行机械负荷的时间作为变量时，一定的固定时间之后再进行活动在腱骨愈合过程中更具优势[20]。这种固定时间似乎与隧道外模型有所不同，较短时间的固定辅以低应力的刺激可以在远期展现出更加稳定的腱骨界面，但是暂时无法将最佳的负荷时间同步应用到人类的康复过程中。

2.3 两种类型模型产生差异的可能原因

不同的模型产生了不同的愈合效果，在移植物以附着的方式与骨骼相接触的模型中，无机械刺激的腱骨界面有着更具优势的愈合，而当移植物在骨隧道中时，早期较低强度的刺激和较短的固定时间均可以提高腱骨复合物的生物力学强度与组织连续性。

机械刺激可以促进TGF-β的表达，这一细胞因子的两个亚型(TGF-β1，TGF-β3)均与腱骨愈合有密切联系[23-26]。TGF-β3可以促进细胞外基质的形成，显著增强腱骨界面的结构和机械性能，在胎儿和新生儿环境中促进皮肤伤口和肌腱愈合并不形成疤痕。同时TGF-β3对于愈合过程的加速效应也是明显和全程的。遗憾的是，TGF-β3未在成人的肌腱愈合中发现。而另一亚型TGF-β1同样影响着腱骨愈合。Wang等人对于TGF-β与腱骨愈合之间的关系有着更加深入的研究。在对新西兰白兔行前交叉韧带重建术后6周，TGF-β过表达组形成了更加明确的软骨区域，而即使在12周后抑制组中肌腱与骨骼仍未形成有效的连接。三维CT的结果也提示TGF-β过表达组可能促进更多的新骨形成从而降低术后骨隧道扩大的发生[27]。另一方面，机械刺激对于骨髓间充质干细胞(BMSC)同样具有加强增殖、分化同时抑制凋亡的调节[28]。TGF-β同时又可以对骨髓间充质干细胞(BMSC)产生募集作用，两者均受机械刺激的正向调控，并都对腱骨愈合产生促进作用。但是这种愈合优势在早期可能会被过多的瘢痕组织所影响进而降低远期复合物之间的愈合。在穿过骨隧道的模型中由于受到更多骨髓组织的影响，机械刺激对于BMSC的促进作用会被放大，这与仅仅附着在骨表面的模型是截然不同的。猜测可能造成了以类似肩袖损伤后修复为原型的动物模型中机械刺激对于腱骨愈合的负面结果。深层次的原因需要更多的实验研究去证实。