李爽，张丽艳，李雪建，周义，金戈

（沈阳医学院基础医学院 1.病理生理学教研室；2.药理学教研室，沈阳 110034）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以记忆力减退、认知功能障碍以及神经元受损为特征的神经退行性疾病，病理表现为老年斑、神经纤维缠结形成和突触功能障碍等［1］。AD发病机制复杂，在众多假说里，β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）异常沉积占主导地位［2-3］。最近有研究表明，在多种疾病模型中，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通过参与神经元成熟和突触重塑发挥神经营养作用［4-5］。在APP/PS1双转基因型AD小鼠中，大脑皮层和海马区BDNF的表达量低于野生型小鼠，并伴随着神经元凋亡和空间学习记忆能力减弱［6］。在本课题组的前期研究［7］中，Aβ诱导的AD大鼠模型BDNF表达下降，外源性给予BDNF后认知功能改善。这些数据表明，BDNF在AD模型中发挥神经营养作用，但其作用机制尚不清楚。经典瞬时受体电位通道（canonical transient receptor potential channel，TRPC）家族成员TRPC3在平滑肌、大脑和小脑组织高度表达。有研究［8］报道，在小鼠胚胎干细胞的分化过程中，TRPC3对神经元的存活、多能性和分化方面有重要作用。在癫痫大鼠海马神经元原代培养中，发现BDNF和TRPC3的表达增加，减轻了癫痫引起的细胞损伤和癫痫发作［9］。在心肌梗死大鼠模型中，BDNF/酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）通过调控TRPC3/6通道，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌细胞凋亡［10］。这些数据表明，BDNF可能通过TRPC3通路发挥神经营养作用。本课题组的前期研究［7］表明，在Aβ诱导的AD大鼠模型中，外源性给予BDNF后TRPC3表达增加且认知功能改善，但BDNF与TRPC3的相互关系尚需进一步确定。本研究通过建立AD小鼠模型，内源性激活BDNF，上调、下调TRPC3的表达，观察小鼠的行为学和神经突触功能，明确BDNF是否通过TRPC3改善AD小鼠的认知功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物分组和处理：80只5周龄雄性费城癌症研究所小鼠（购自辽宁长生生物技术有限公司），体质量20～24 g，适应性喂养5 d，随机分为对照组、AD组、AD+TrkB受体激动剂7，8-二羟基黄酮（7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF）组（AD+7，8-DHF组）、AD+TRPC3激动剂二酰基甘油类似物（1-oleoyl-2-acetyl-snglycerol，OAG）组（AD+OAG组）和AD+7，8-DHF+TRPC3抑制剂吡唑化合物（pyrazole compound，Pyr3）组（AD+7，8-DHF+Pyr3组），每组16只。第6天对照组小鼠给予灭菌生理盐水侧脑室注射，其他4组小鼠给予Aβ1-42侧脑室注射，建立动物模型。待小鼠恢复体力后，AD+7，8-DHF组、AD+OAG组 和AD+7，8-DHF+Pyr3组分别给予7，8-DHF（5 mg/kg）、OAG（0.6 mg/kg）、7，8-DHF（5 mg/kg）和Pyr3（0.1 mg/kg）腹腔注射［11-13］，每日给药1次，连续给药21 d后分离小鼠的海马组织和全脑。TrkB受体激动剂7，8-DHF用于内源性激活BDNF信号传导途径［14］，TRPC3激动剂OAG和TRPC3抑制剂Pyr3分别用于上调和下调TRPC3的表达。

1.1.2 试剂：Aβ1-42和钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-α（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ-α，CaMKⅡ-α）兔单克隆抗体（英国Abcam公司）；7，8-DHF（大连美伦生物）；OAG和Pyr3（美国Cayman公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天公司）；TRPC3兔多克隆抗体（台湾Arigo公司）；synapsin-Ⅰ兔单克隆抗体（美国Cell 公司）；β-actin小鼠单克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG（中国Boster生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制备：将Aβ1-42溶于DMSO中，终浓度控制在0.3%（用无菌生理盐水稀释），然后在37 ℃温箱中孵育120 h。根据小鼠脑立体定位图谱（第2版）确定侧脑室注射位点为前囟后0.5 mm，中线向右旁开1.1 mm。用微量注射器缓慢注射Aβ1-42 3 μL，注射速度为0.6 μL/min，留针5 min。

1.2.2 Morris水迷宫实验：Morris水迷宫是评估小鼠空间学习和记忆的经典测试［15］。水迷宫实验（中国上海吉良软件技术有限公司）从造模后第16天开始，持续6 d。圆形水池中装满黑色墨水，平台固定在水池的第三象限，水位在平台上1 cm处，水温保持在（25±1）℃。水迷宫实验包括定位航行实验（前5 d）和空间探索实验（第6天），分别测量小鼠的学习和记忆能力。前5 d，将小鼠面对水池壁于不同的象限放入水中，寻找隐藏的平台，每日3次。第6天，将平台移走，观察小鼠在1 min内的动作轨迹。

1.2.3 ELISA：使用ELISA试剂盒（台湾Arigo公司），利用酶标仪测量海马中Aβ1-42的浓度（n=6）。Aβ1-42浓度（ng/mL）=样品浓度×稀释倍数。

1.2.4 Western blotting：海马组织中加入含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液吹打混匀后进行超声处理，处理完后冰上静置0.5 h，高速离心10 min。取少量上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，剩余上清液加蛋白缓冲液进行100 ℃沸水浴变性。取30 μg变性后的蛋白溶液上样于5%SDS-聚丙烯凝胶中，室温下电泳2 h，4 ℃下用转膜仪（中国天能公司）将蛋白转移到硝酸纤维素膜1 h。将膜浸泡在含有5%脱脂牛奶的TBST中，摇床上室温封闭1.5 h，TBST漂洗3次，每次15 min。之后分别与TRPC3小鼠多克隆抗体（1∶500）、synapsin-Ⅰ（1∶2 000）、CaMKⅡ-α（1∶10 000）和β-actin（1∶1 500）4 ℃孵育过夜。第2天，TBST 漂洗3次，4 ℃摇床上与辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）孵育2 h，TBST漂洗3次。最后，用化学发光成像系统（中国天能公司）进行ECL显影并用Image J软件进行条带灰度的定量分析。

1.3 统计学分析

采用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学处理，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 激活BDNF和TRPC3对AD小鼠空间学习记忆能力的改善作用

水迷宫实验结果显示，与对照组小鼠相比，AD组小鼠第5天逃避潜伏期延长（P＜0.001），第6天目标象限停留时间减少（P＜0.001），第6天穿越平台次数减少（P＜0.05），结果表明，AD组小鼠的空间学习记忆能力下降。与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠第5天逃避潜伏期缩短（P＜0.01），第6天目标象限停留时间增加（P＜0.01），第6天穿越平台次数增加（P＜0.05），结果表明，内源性激活BDNF和上调TRPC3后，AD小鼠空间学习记忆能力得到明显改善。见表1。

2.2 激活BDNF和TRPC3能够减轻Aβ1-42异常沉积

采用ELISA检测各组海马Aβ1-42浓度，对照组、AD组小鼠、AD+OAG组、AD+7，8-DHF组和AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠Aβ1-42浓度分别为（271.1±34.03）、（837.9±66.09）、（523.6±79.29）、（458.7±59.37）、（954.8±23.19）pg/mL。与对照组相比，AD组小鼠Aβ1-42浓度增高（P＜0.001）；与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠Aβ1-42浓度降低（均P＜0.01）。结果表明，激活BDNF和TRPC3减轻了Aβ1-42的异常沉积。

表1 Morris水迷宫实验中各组小鼠行为学检测结果Tab.1 Behavioral results of mice in each group in the Morris water maze test

2.3 激活BDNF和TRPC3促进突触相关蛋白synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α的表达

Western blotting结果显示，与对照组小鼠相比，AD组小鼠TRPC3、突触相关蛋白（synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α）表达均降低（分别为P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），表明AD组小鼠神经突触功能受损。与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠TRPC3、突触相关蛋白（synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α）表达均增加（分别为P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01），表明激活BDNF和TRPC3明显改善神经突触功能。见图1、表2。

2.4 BDNF通过上调TRPC3减轻Aβ沉积进而改善AD小鼠的认知和神经突触功能

水迷宫实验结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠第5天逃避潜伏期延长（P＜0.001），第6天目标象限停留时间减少（P＜0.01），第6天穿越平台次数减少（P＜0.05），结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠认知功能的改善作用。见表1。

图1 Western blotting检测各组小鼠海马区TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表达Fig.1 Expression of TRPC3，synapsin-Ⅰ，and CaMKⅡ-α proteins in the hippocampus of mice in each group detected using Western blotting

ELISA结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠Aβ1-42浓度显著降低（P＜0.001），结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠中Aβ1-42沉积的清除作用。

Western blotting结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表达均降低（分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠神经突触功能改善作用。见表2。

以上结果表明，BDNF通过上调TRPC3的表达减轻了Aβ异常沉积，进而改善AD小鼠的认知和神经突触功能。

3 讨论

已有研究［16-17］报道，BDNF在AD模型中表达下降，上调BDNF后AD模型认知和神经突触功能得到改善，但TRPC3对AD的认知和神经突触功能的作用未见报道。本课题组的前期研究［7］发现，AD大鼠中BDNF和TRPC3蛋白表达降低，侧脑室注射BDNF后TRPC3表达增加，认知功能得到改善。本研究中，AD小鼠TRPC3表达降低，给予7，8-DHF（内源性激活BDNF）后TRPC3表达增加，与之前的研究结果一致。给予OAG（激活TRPC3）后TRPC3表达增加，AD小鼠认知和神经突触功能改善，说明TRPC3具有改善AD小鼠认知和神经突触功能的作用。另外，上调BDNF后AD小鼠的认知和神经突触功能得到改善，但抑制TRPC3通道后再上调BDNF，AD小鼠认知和神经突触功能并未得到改善，说明BDNF通过上调TRPC3的表达来发挥神经保护作用。

表2 各组小鼠海马区TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白的相对表达量Tab.2 Relative expression of TRPC3，synapsin-Ⅰ，and CaMKⅡ-α proteins in the hippocampus of mice in each group

Aβ是由β淀粉样蛋白前体蛋白水解而成，其在脑内异常沉积形成老年斑。老年斑是AD的主要病理变化，也是神经元死亡的关键因素［18］。本研究中，上调BDNF和TRPC3均使AD小鼠Aβ沉积减轻，而使用TRPC3抑制剂上调BDNF并没有减轻Aβ沉积，说明BDNF可能通过TRPC3清除Aβ沉积，从而达到神经保护作用。但TRPC3通过何种途径清除Aβ沉积，具体机制并不清楚。目前，Aβ主要通过血脑屏障和脑血管周隙-淋巴2种途径进行清除［19-20］。但有研究［21］报道，缺氧模型中TRPC通过钙离子内流导致血脑屏障受损。因此，TRPC3是否影响血脑屏障以及是否通过血脑屏障清除Aβ沉积，尚需进一步研究证明。

已有研究报道，在急性心肌梗死大鼠模型中BDNF/TrkB通过TRPC3通道抑制缺血引起的心肌细胞凋亡［10］。嗅鞘细胞的迁移对神经再生和嗅觉发育至关重要。WANG等［22］发现BDNF通过TRPC3促进嗅鞘细胞的迁移。然而，ARAVAMUDAN等［23］认为，TRPC3/6正向调控BDNF的释放，在哮喘患者气道平滑肌细胞中，以RNA干扰技术检测到TRPC3/6通过调控BDNF的分泌来调节气道平滑肌的变化。这些证据说明，BDNF和TRPC3具有协同作用，但具体机制有待进一步探讨。

综上所述，本研究表明，BDNF/TrkB通过调节AD小鼠海马中TRPC3的表达，减轻Aβ的沉积，从而发挥其对AD小鼠认知功能和突触功能障碍的改善作用。BDNF和TRPC3激动剂可能成为AD治疗的候选药物。