徐美慧 张耀杰 唐克轩， 苗志奇

（上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

合成生物学是将现代工程学原理和方法应用到生物学的一种新的研究领域［1-2］。合成生物学通过采用自下而上的研究方法实现了人工生物体系的建立［3-5］，已经应用于药物合成［6-9］和个性化医疗［10-15］等多个领域。DNA组装是合成生物学的重要基础技术，是构建基因表达系统乃至整个染色体的关键环节［16-17］。传统的基于限制性消化和连接的克隆方法较为冗长耗时，而且不适合高通量DNA组装和多个DNA片段的同时组装，无法进行需要更高效率和保真度的复杂DNA结构设计［18-19］。近年来，为了适应快速发展的基因组设计，已经开发大量新的高效率、高保真度并且模块化的DNA组装方法［20-22］。

Golden Gate是一种利用ⅡS型限制性核酸内切酶介导DNA组装的新方法，可以实现多个DNA片段的高效“无缝”组装，已经被用于拥有重复的复杂二级结构的激活子的拼接和多重CRISPR-Cas9基因编辑等领域［16，23-25］。Golden Gate的主要优点是可以将其模块化，而模块化是合成生物学的一个标志，但和许多方法一样Golden Gate在标准化和可重复性方面存在一定限制［26-27］。GoldenBraid（GB）是一种基于Golden Gate的标准化组装系统，可以在一个反应中实现多个标准化元件的无痕定向快速组装，并允许由标准化DNA片段组成的可重复使用的基因模块通过二进制组合无限生长［27］。GB系统不需要进行额外的PCR扩增和载体线性化的步骤，还允许在一步反应中进行限制消化-连接循环，使反应结束时只保留正确的组合，极大地提高了反应效率并节省了实验时间［24］。……