宁素云，滕 丹，慕杨娜，王 祎，孙笑宇

（1.山西药科职业学院，山西太原 030031；2.辽宁何氏医学院，辽宁沈阳 110163；3.辽宁省中医研究院，辽宁沈阳 110034）

随着生活水平的日益提高,高血脂症已经逐渐成为我国最为常见的慢性病之一。高血脂症状诱发的一系列疾病,如糖尿病、高血压、脑卒中及心梗等的高风险因素［1］。根据《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》 数据显示,我国血脂异常人数已达到4.3亿,而且诱发的冠心病的发病率以每10年30%的速度递增［2］。由于高血脂症属于代谢类慢性疾病,合理的饮食可以有效防治高血脂症的发生,然而,考虑到人群饮食习惯难于改变,而以药物对高血脂症进行纠正常常无法被患者接受,且存在用药风险［3］,因此探讨药食同源的药物改善高血脂症,是一个很好的解决方法［4］。

现有的研究显示,有大量的中药/有效成分可对血脂异常进行治疗。如药物有红曲、泽泻、大黄、虎杖、何首乌、决明子、绞股蓝等,而有效成分则有麦角甾醇、生物黄酮、皂苷、氨基多糖、不饱和脂肪酸等［4］。相比其他中药饮片,山楂的调脂功能及应用潜力更大。首先,根据以往的研究,山楂本身含有多种活性成分,如黄酮、有机酸、膳食纤维和固醇等［5］。其中,山楂黄酮是最重要的降脂有效成分之一［6］。另一方面,山楂是国家卫生健康委员会公布的第一批药食同源中药材之一。因此,山楂除了可配伍药物直接组方降脂外,亦可安全地应用于食品。然而,现针对山楂降脂研究多集中于对其血脂水平的调节［7］,或者对其单一组分的药理学研究［8］,而对药物整体起效机制的研究较少。考虑到山楂有效成分的复杂性,对单一成分、单一参进行简单的研究,已经无法系统了解山楂降低血脂的起效机制。基于此,本研究拟通过肠道菌群变化的方式,间接的分析其起效机制［9］。

越来越多的证据表明,肠道微生物对于高胆固醇血症的形成有重要作用,甚至肠道菌群失衡是动脉粥样硬化独立的危险因素之一［10］。而微生物群落构成,也在脂肪的代谢过程中发挥了重要的作用［11］。大量研究显示,有效成分可通过对肠道菌群的调节,加速胆固醇的代谢,并进一步降低高血脂症的发生［12-14］。而以肠道微生物为切入点,对成分复杂的食物/药物进行机制研究,是解决复杂机制研究的一个重要的手段。基于上述研究背景,本研究基于肠道菌群变化对山楂饲食前后,小鼠肠道微生态的演替情况进行分析,并进一步推测山楂改善高脂模型小鼠的血脂变化的肠道微生物作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究共纳入30只28～56日龄的小鼠为研究对象,除6只为C57BL/6 J小鼠（SCXK苏202015-0001）外,其余24只均为ApoE -/-小鼠 （SCXK苏202015-0001）,上述小鼠购买自北京隆安实验动物养殖中心［许可证号SCXK （京）2014-0040］。所有小鼠均按照国家啮齿类动物饲养标准,饲养于辽宁中医研究院动物实验中心。

1.2 材料与仪器 山楂冻干粉（批号SH-01-02,西安首禾生物科技有限公司,每克冻干粉相当于10 g山楂生药）；E.Z.N.A.® Stool DNA试剂盒 （批号D4015,美国Omega Bio-tek公司）；AxyPrep PCR clean up Kit （批号APPCR-250G,美国Axygen公司）；Quant-iT Pico Green ds-DNA Assay Kit （批号P11496,美国Thermo Fisher Scientific公司）；MiSeq Reagent Kit V3 （600 cycles）（批号MS1023003,美国Illumina公司）；AU5800型全自动生化仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 分组及建模 6只C57BL/6 J小鼠为正常组,常规饮食喂养；常规鼠粮配方为面粉20%、米粉10%、玉米20%、麸皮26%、豆饼20%、鱼粉2%以及骨粉2%。其余24只ApoE-/-小鼠均予高脂高胆固醇饮食饲养,该饲料是在常规饲料的基础上,增加15%动物油和0.25%胆固醇。

经过7 d适应性喂养后,依据小鼠体质量随机为4组（每组6只）。其中,对照组常规高脂高胆固醇饮食饲养+生理盐水灌胃。高、中、低3个剂量组常规高脂高胆固醇饮食饲养+山楂冻干粉灌胃,添加剂量分别为1、2、5 g/（kg体质量）的山楂冻干粉水溶液。实验共进行12周,小鼠在最后一次灌胃山楂冻干粉水溶液后,禁食24 h,腹腔麻醉后处死小鼠,同时取小鼠的血样及大肠内容物,做下一步分析。

1.4 血清脂质水平 动脉取血后,分别应用全自动生化仪器测定小鼠血清内的TG、TC、LDL-C及HDL-C等参数的水平。

1.5 肠道微生物测序及生物信息学分析 应用粪便DNA试剂盒对研究所收集到的肠道内容物样本进行提取,电泳检测样本提取质量,并以紫外分光光度计对所得的DNA样本进行定量。设计16SrDNA保守区的通用引物,并添加测序通用接头和样本特异性Barcode序列,ACTCCTACGGGAGGCAGCAG （通用引物为338F）,GGACTACHVGGGTWTCTAAT （通用引物为806R）,对rRNA基因可变区（V3+V4）或特定基因片段进行PCR扩增。将PCR扩增的产物通过2%浓度的琼脂糖-凝胶电泳进行检测,并对目标片段进行针对性的回收,保证插入的片段范围为200～450 bp。在Promega Quanti Fluor荧光定量的系统内,应用DNA检测试剂盒对纯化后的PCR产物对比文库进行定量,确定获得的PCR浓度为2 nmol/L以上。梯度稀释合格的上机测序文库,依据测序量进行混合,NaOH变性后,使所得的PCR变为单链,再进一步上机测序。测序以MiSeq进行2×300 bp的两端测序,应用overlap对获得的初始数据进行拼接,质控后进行嵌入过滤,最终获得初始数据（rawdata）并再进一步转化为对应的可操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs）。

应用vegan包对获得的OTUs在R系统内绘制所获得菌种丰富度指数（chao1指数）对应的稀疏曲线；主成分分析（principal components analysis,PCA）则以SMICA 14.1软件进行,首先提取各样本小鼠粪便样本内对应的OTUs,应用excel生成为SMICA 14.1所需的格式,载入软件后进行数据转化,其中,Model type选择PCA-x,对所得数据进行autofit后,获得PCA评分散点图；为考察各组菌群的具体分布情况,根据各水平下的OTUs,以TBtools软件的heatmap包制备热图,再根据各组内样品OTUs的平均值,制备柱状图,最终确定各样本内主要菌群在门及属水平的分布情况；在线进行LEfSe分析（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）,分别提取模型-正常、低剂量-模型、中剂量-模型及高剂量-模型等4对数据,分别对其进行线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size,LEfSe）分析,对比各组的线性判别分析 （linear discriminant analysis,LDA）值变化；分别抽取各组的在门水平及属水平的LDA值,两两对比后,应用TBtools的heatmap包,制备热图,最终确定模型组内重要的差异菌群。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0对所得数据进行统计,计量资料以（）表示,组间对比应用独立样本t检验进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山楂粉对于小鼠血脂的影响 经过12周的自由进食后,小鼠的血脂具体变化如表1所示。结果提示,与空白组比较,模型组小鼠血液内的TG、TC、LDL-C含有量显著升高（P＜0.01）,HDL-C含有量显著下降（P＜0.01）。给药组,随着鼠粮内山楂的不断摄入,小鼠血液内的TG、TC、LDL-C含有量也开始下降,HDL-C含有量升高。其调节血脂异常的效果,同添加的山楂粉剂量相关。相比于其山楂低、中剂量组,高剂量组更能显著降低小鼠内的TG、TC及LDL-C水平,同时提升HDL-C的水平（P＜0.05,P＜0.01）,然而,仍然同正常组有较大的区别。结果提示,山楂粉可有效地缓解高脂饮食所致的血脂异常且呈剂量依赖性。

表1 山楂冻干粉对小鼠血脂水平的影响（， n=6）

表1 山楂冻干粉对小鼠血脂水平的影响（， n=6）

注：与正常组比较,##P＜0.01；与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 山楂粉对小鼠肠道菌群多样性变化的影响 为了获得山楂粉对小鼠肠道菌群微生态的影响,本研究考察了5组小鼠的肠道菌群查奥1 （Chao1）值的变化情况,Chao1指数可反映样品内微生物群落的丰度和多样性情况,即α 多样性指数信息。其具体变化趋势如图1所示。由结果可知,高剂量组的Chao1指数显著性高于其他4组,而低剂量组的Chao1指数则低于其他各组。上述结果提示,随着山楂粉剂量增加,可大幅提升小鼠体内的菌群丰富程度。同时,根据所得结果可以看出,在整个饲养过程中,正常组及模型组内丰度的变化,基本无太大的波动。可以推测,两组间虽然菌群的构成出现差异,但是丰度的变化情况类似,为进一步类比上述5组小鼠肠道菌群的变化情况,本研究对获得的OTUs信息进行了主成分分析。

图1 不同剂量山楂冻干粉对小鼠肠道菌群稀释曲线的影响

2.3 山楂粉对大鼠肠道菌群主成分差异性分析 PCA分析（主成分差异性分析）可有效地对获得的复杂数据进行降为处理,同时对比统计不同组别内数据的构成相似度。本研究应用PCA分析,考察了山楂粉对小鼠肠道菌群构成的影响。由图2可知,高脂饮食可直接影响小鼠的肠道菌群构成,虽然模型组及正常组的Chao1指数变化接近,但两组的肠道菌群构成有很大区别。随着山楂粉的添加,小鼠的肠道菌群构成也开始和正常组类似。但是,不同剂量山楂粉亦会直接影响小鼠的菌群构成。如低剂量组和高剂量组的菌群构成较为集中,而中剂量组的变化则较大。由PCA的结果可知,山楂粉的添加可以有效的改善高脂膳食小鼠的菌群构成情况。然而,其同正常组相比仍有很大的差异性,特别是中剂量组,虽然其菌群构成同模型组有很大区别,但是同正常组比较,仍然区别较大。基于此,本研究进一步分析不同水平下菌群变化的情况,以确定不同组内小鼠的肠道菌群变化情况。

图2 不同剂量山楂冻干粉对小鼠肠道菌群构成的影响

2.4 山楂粉对小鼠肠道菌群构成的影响 图3展示了不同组内小鼠在门水平上的构成情况。由结果可知,相比于模型组,其他各组内拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）的水平显著性上升。而厚壁菌门（Firmicutes）的变化趋势并不明显。而上述4门为各组内的优势菌群。而相比于其他各组,模型组小鼠内的无法分类的细菌（Bacteria_ unclassified）丰度更高。

图3 小鼠肠道内容物肠道菌群在门水平上的相对丰度

图4 小鼠肠道内容物肠道菌群在属水平上的相对丰度

图4展示了不同组内小鼠在菌属水平上的构成情况。由结果可知,和门水平相比,各个组内菌属的分布更加分散,而最主要的变化是芽孢杆菌（Bacllaceae_ 2_ unclassified）属、Parasutterella属、拟杆菌属（Bacteroides）属和Coprpcpccus属。相比于模型组,其他4组的Bacllaceae_ 2_unclassified的丰度大幅下降,而 Parasutterella属、Bacteroides属和Coprpcpccus属的丰度则大幅上升,结果提示,上述菌属是直接影响高脂模型小鼠菌群差异的关键菌属。考虑到不同饲喂方式,对小鼠肠道微生态的影响较大,为了进一步全面对比各组内菌群丰度的变化情况,本研究进一步对菌群进行了β 分析,已获得山楂粉缓解小鼠高脂模型的关键菌门/属。

2.5 山楂粉调节小鼠肠道菌群构成的主要差异菌群 为了获得山楂粉调节小鼠肠道菌群微生态的主要差异菌群,本研究应用LEfSe分析对获得的数据进行了β 差异性分析。对获得的OTUs的LDA进行统计后,获得的结果如图5所示。由图5D可知,正常组及模型组的菌群构成差异性较大,在各个水平上（门纲目科属种）,共有62个OTUs出现了差异性。另,随着山楂粉的增加,各组同模型组的差异性也随之增加,如低剂量组-模型组（图5A）、中剂量组-模型组（图5B）及高剂量组-模型组（图5C）的OTUs差异值分别为35、48、68。该结果提示,随着山楂粉剂量的不断增加,模型组内小鼠肠道菌群的构成也随之大幅改变。为了进一步的对比各组变化的菌群及趋势,本研究分别以各组同模型组OTUs的LDA值制作热图,见图6。

由图6A可知,在门水平上,正常组-模型组及山楂高剂量组-模型组的差异性相似程度最高,除了Bacteroidetes外,其他各主要构成菌门的构成基本一致。与之相对,除Deferribacteres （脱铁杆菌门）外,山楂低剂量组-模型组各主要构成菌门的构成基本无差异性。该结果提示,随着山楂粉的不断增加,模型小鼠的肠道菌群构成会随时发生变化,并趋近于正常组小鼠的情况。虽然可以显著改善模型小鼠的血象（P＜0.05,P＜0.01）,但是其仍然高于正常组（P＜0.05,P＜0.01）。

由图6B可知,在属水平上,其结果同门水平的结果类似。正常组-模型组及山楂高剂量组-模型组的差异性相似程度最高,而山楂低剂量组-模型组各主要构成菌门的构成基本无差异。经过对属水平分析后可以看出,肠杆菌（Enterobacier）、支原体（Mycoplasma）在低剂量组及模型组的构成无差异,而在其他3组内均显著上升（| LDA | ＞2.0）。而毛螺旋菌属 （Parasutterella ）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、毛螺菌属 （Lachnospiraceae_ unclassified）及艾克曼菌属（Akkermansia_ unclassified）则仅仅在正常组及高剂量组中浓度显著性上升（| LDA | ＞2.0）可以将上述菌群,视为山楂粉改善肠道菌群构成的生物标志物。

3 讨论

作为药食同源的药物,山楂具有调节高血脂症的功能［7］。然而,此类报道多以复方或有效成分角度出发［15-16］,针对山楂饮片降血脂的研究并不多见。另一方面,在高莹等［17］的研究中,山楂和山楂黄酮虽然可以显著降低大鼠血清的TG水平,但是对大鼠血清TC没有明显的改善作用,其推论山楂改善血脂的功能同饲料的配方关系密切。在本实验中,虽然山楂粉可以改善小鼠的TG、TC、LDL-C及HDL-C等血脂指标。然而,即使摄入了山楂粉,小鼠的血脂浓度仍同正常组有很大的区别（P＜0.05）。另一方面,赵尹铭等［18］报道山楂的降血脂有效成分有黄酮、熊果酸及山楂膳食纤维等。上述研究提示,山楂改善高血脂症的机制极为复杂,而单纯以山楂粉治疗小鼠的高血脂症,将是一个长期逐渐改善的过程。因此,对其机制的分析,相比于单纯的血脂参数研究,以肠道菌群构成变化的角度为切入点,是一个良好的解决方案。

高脂饮食（high fat diet,HFD）诱发高血脂症可致肠道微生态的变化被广泛报道［19-20］。毫无疑问,HFD可致血脂积累,并进一步诱发高血脂症,而在此过程中,肠道微生态起到了决定性的作用［21］。在高脂饮食的摄入过程中,小鼠肠道内产生的乙酸菌会过度繁殖,并进一步提升小鼠肠道代谢物内乙酸的浓度,而随着乙酸浓度的上升,其可刺激β 细胞分泌了更多的胰岛素,并上调小鼠体内胃泌素和胃饥饿素分泌［22］,通过对肠-脑轴线（gut-brain axis）的调整,增加小鼠对食物的摄入。而HFD可调整肠道代谢物的组成,最终引起肠道微生态的改变［23］。考虑到肠道微生态同脂肪代谢的相关性,可以推测,山楂在改善血脂症的过程中,亦会直接影响模型小鼠的肠道微生态变化。

本实验中,相比于其他4组,高剂量组获得了最高的Chao1指数。该结果表明,大量摄入山楂粉,可以通过提升HFD小鼠肠道菌群的丰富程度,快速调整HFD小鼠的肠道微生物构成。另一方面,根据Chao1指数可以看出,其他4组小鼠的肠道微生物丰富程度接近,结果提示,在中低剂量下,山楂对HFD小鼠肠道微生物的调整较为温和。为了进一步确定各组小鼠肠道微生物的差异性,本研究对样本进行了PCA分析,相比于模型组,低剂量组及高剂量组都和正常组更为接近。虽然中剂量组的离散情况较为严重,但是参考低剂量组及高剂量组的结果,可以推测其是在不断调整菌群构成的过程中。由此可知,在山楂缓解HFD小鼠高血脂症的过程中,小鼠的肠道微生态也随之改变,且HFD小鼠肠道菌群的构成情况趋于正常。

根据对小鼠肠道微生物构成的α 分析结果可知,相比于模型组,山楂粉组及正常组内拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门 （Proteobacteria）、疣微菌门 （Verrucomicrobia）的水平显著性上升。而厚壁菌门（Firmicutes）的变化趋势并不明显。根据文献报道,拟杆菌门（Bacteroidetes）同小鼠肥胖发生的关系密切,小鼠长期摄入HFD,肠道内的拟杆菌门丰度会随之下降［24］。除拟杆菌门外,厚壁菌门的丰度也同HFD相关。根据Vaughn等［25］的研究,随着HFD的摄入,小鼠肠道内的厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteriodetes,F/B）比值会随之增加。根据本研究的结果,随着山楂粉的摄入,HFD小鼠的肠道微生物F/B值会随之下降,提示山楂粉有调节F/B值的效果。属水平上,相比于模型组,其他4组的bacllaceae_ 2_ unclassified的丰度大幅下降,而Parasutterella属、Bacteroides属和Coprpcpccus属的丰度则大幅上升。其中,Parasutterella同血脂胆固醇代谢的关系密切。在Yin等［26］的研究中,小鼠对于HFD的响应程度很高,而当以褪黑素调节HFD小鼠脂代谢紊乱时,拟杆菌、Alistipes和Parasutterella的相对丰度会随之增加。根据Nadal研究可知［27］,bacteroides属同肥胖患者体质量下降反向相关,可以推测,bacteroides属可加速脂肪的代谢。

图5 小鼠肠道内容物肠道菌群的LEfSe分析

图6 小鼠肠道内容物肠道菌群的在门及属水平上的差异值LDA值分布

本研究进一步应用β 分析对获得的结果进行确认。根据LEfSe检验结果可知,随山楂粉饲食剂量的上升,各组小鼠肠道菌群差异性与模型组相比,显著性提升。结果提示,随着山楂粉剂量的增加,小鼠肠道微生态调整的也随之加速。另一方面,本研究又通过LDA值进一步筛选出了山楂改善小鼠高血脂症的关键微生物,分别为Parasutterella、Escherichia、Lachnospiraceae_ unclassified及Akkermansia_ unclassified。刘思颖等研究［28］在HFD所致脂代谢障碍的小鼠肠道内,粪球菌属Akkermansia及Lachnospiraceae较正常组减少,随着黄芩苷的干预,上述2个菌属会显著上升；和其研究类似,由于上述两者仅仅在正常组及山楂高剂量组中剂量显著性上升| LDA| ＞2.0）,结果提示,在山楂调节脂代谢的过程中,需要在较高剂量下,长时期的饲食,方可实现对血脂的控制。可以确定,上述菌属是改善小鼠高血脂症的过程中的关键菌属。

综上所述,山楂粉可以有效缓解HFD所致的脂代谢紊乱的症状,加速肠道菌群的恢复,并通过对特定菌群的调整,实现其调节血脂代谢的目的。然而,本研究仅仅针对菌群的群落变化进行了研究,若要进一步的完善其机制,则需要通过对粪便的代谢组学进行交叉对比后,方可实现。