张二飞，殷 紫，齐 越

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003；2.江苏护理职业学院，江苏淮安 223005；3.江苏省徐州医药高等职业学校，江苏徐州 221116）

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,在1817年被首次发现并命名［1］。其主要临床症状表现为运动迟缓、肌肉僵直等现象［2］。PD的病因尚不明确,致病机制复杂多样,目前研究认为包括环境因素、细胞中亚细胞器结构的破坏、氧化应激、神经炎症等［3］。而神经炎症是众多退行性疾病和衰老的主要病理特征之一,其中介导中枢神经系统炎症反应的关键免疫细胞为小胶质细胞,活化的小胶质细胞释放大量促炎因子,损伤血脑屏障和神经突触,引发中枢神经系统稳态的失衡［4］。目前,关于针对神经炎症临床治疗的药物尚不能有效地控制PD的发展与不良反应的产生,因此,深入对神经炎症的机制研究,开发具有多靶点、安全有效的治疗药物尤为重要。大量基础研究与现代药理学分析显示：白藜芦醇（resveratrol,RSV）具有抗炎、抗氧化损伤等多种作用［5-7］。本研究通过研究白藜芦醇对LPS和ATP诱导的小胶质细胞凋亡作用的影响,深入探讨其作用机制,以期为神经炎症的体外细胞水平研究增加新的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 蛋白凝胶电泳-电转系统（美国Biorad公司）；BCA蛋白定量双波长酶标仪、冷冻离心机（美国ThermoFisher公司）；ECL曝光显影系统 （美国 GE Healthcare公司）；Hoechst荧光显微镜 （日本NIKON公司）；白藜芦醇（美国Selleck公司,批号S1396）；胰酶（碧云天生物技术公司,批号C0202-100 ml）；胎牛血清（FBS,美国ThermoFisher-GIBCO公司,批号10099-141）；F12-DMED （美国 ThermoFisher-GIBCO公司,批号C11330500BT）；脂多糖 （LPS,美国Sigma-Aldrich公司,批号L2880-25 mg）；三磷酸腺苷（ATP,美国Selleck公司,批号S1985）；RIPA裂解液（江苏凯基生物公司,批号KGP703-100）；Hoechst荧光染料（美国ThermoFisher-Invitrogen公司,批号H1399）；磷酸盐缓冲液（PBS,江苏凯基生物公司,批号KGB003）；甘油（江苏凯基生物公司,批号KGT519100）；一抗兔抗TLR4 （1 ∶ 1 000,英国Abcam公司,批号ab13556）；兔抗p-NF-κB （1 ∶1 000,美国CST公司,批号3033）；兔抗NF-κB （1 ∶1 000,美国CST公司,批号8242）；兔抗IL-1β （1 ∶1 000,美国CST公司,批号83186）；鼠抗BCL-2 （1 ∶1 000,美国CST公司,批号15071）；兔抗BAX （1 ∶1 000,美国CST公司,批号5023）；鼠抗ACTIN （1 ∶2 000,Santa公司,批号SC-47778）；二抗Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP与Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP （美国Invitrogen公司,批号31460,批号62-6520）。

1.2 小胶质细胞来源 本研究所用小胶质细胞为原代小胶质细胞,取新生1～3 d C57/B6乳鼠进行实验,实验所用小鼠购自于南京青龙山实验动物基地,生产许可证号SCXK（苏）2017-0001。

1.3 离体细胞水平研究与实验分组 本研究中所使用细胞为小鼠原代小胶质细胞。1～3 d新生C57乳鼠通过剥离脑膜,去除脑膜上血丝后,使用0.25%胰酶消化脑组织,过40 μm细胞筛网,所得滤液离心,1 500 r/min离心10 min,将离心所得细胞沉淀重悬后铺种于T25瓶中,加6 mL含有10% fatal bovine serum （FBS）Gibco-F12/DMED培养基,次日更换新鲜培养基,后隔3 d换液,细胞培养至10～12 d可见小胶质细胞长出,用力平摇T25小瓶,吸取瓶内培养基后离心,1 500 r/min离心10 min,所得细胞沉淀即为小胶质细胞,种于24孔板后,次日贴壁,可用于实验研究。实验分为空白组、LPS+ATP组、白藜芦醇组和LPS+ATP+白藜芦醇组。LPS刺激剂量为100 ng/mL （6 h）,ATP为5 mmol/L （30 min）；白藜芦醇预提前给药3 h,给药剂量一次为25 μmol/L。

1.4 Western blot检测相关蛋白表达 RIPA裂解液裂解（含蛋白酶与磷酸酶抑制剂）细胞蛋白后,刮取细胞蛋白,离心16 000 r/min,15 min,弃EP管底部沉淀,吸取上清细胞蛋白进行BCA蛋白定量后,加入5×loading buffer,95 ℃煮沸蛋白使之变性用于后续电泳。细胞蛋白通过电泳、电转将蛋白分子转移至PVDF （聚偏二氟乙烯）膜后,使用5% TBST脱脂牛奶封闭条带1 h后,孵育特异性一抗4 ℃过夜（检测指标为：兔抗TLR4；兔抗p-NF-κB；兔抗NF-κB；兔抗 IL-1β；鼠抗 BCL-2；兔抗 BAX；鼠抗ACTIN）,次日孵育二抗1 h ［Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP与Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP］,TBST洗膜10 min×3次,ECL曝光显影。

1.5 细胞上清的提取 收集细胞上清后,离心1 000 g,5 min,去除死细胞,小心吸取600 μL上清至另一干净EP管中,加入等体积预冷的甲醇和1/4体积氯仿,迅速涡旋震荡后离心,吸弃上清,加入500 μL预冷甲醇后,涡旋震动离心,13 000 r/min离心5 min,小心吸弃上清,将装有沉淀物的EP管置于37 ℃的烘箱中5 min,加入30 μL的2.5×loading buffer溶解,95 ℃煮沸5 min后上样进行Western blot分析IL-β 炎症因子。

1.6 Hoechst细胞凋亡检测 细胞发生凋亡时,染色质有固缩现象,经Hoechst染色后,在荧光显微镜下观察,正常细胞细胞核呈蓝色,而发生凋亡细胞的细胞核会呈现致密浓染,蓝色较淡。每组小胶质细胞种于24孔爬片中进行检测分析,细胞处理后,吸弃培养基,加入磷酸盐缓冲液（PBS）润洗3次,每孔加入500 μL Hoechst染料稀释液（1 ∶3 000稀释）。室温孵育15 min,吸弃染料,PBS润洗3次后,将爬片从24孔板取出,倒扣至载玻片上,PBS加甘油（1 ∶1）封片保存,用于后续显微镜拍摄。

1.7 数据统计分析 数据分析使用Graphpad prism7软件,图例展示均用 （）表示,采用one-way ANOVA和Student’ s t-test进行组间差异分析。 P＜0.05表示有统计学差异。

2 实验结果

2.1 白藜芦醇抑制由LPS和ATP诱发的TLR4/NF-κB/IL-1β 信号通路的激活 原代小胶质细胞种于24孔板后,次日贴壁后可用于实验研究,白藜芦醇提前预孵育3 h,后给予炎症的第一信号LPS刺激6 h,炎症第二信号ATP刺激30 min。通过Western blot检测发现,LPS+ATP组TLR4/NF-κB/IL-1β 信号通路被明显激活,其中LPS+ATP组与空白组相比,TLR4受体上调最为明显,磷酸化的NF-κB蛋白上调,细胞分泌的成熟体IL-1β 也增多 （P＜0.01）。LPS+ATP+白藜芦醇组与LPS+ATP组相比,则减弱了TLR4/NF-κB/IL-1β 信号通路的激活,TLR4受体下调明显,磷酸化NF-κB蛋白下调最明显,细胞分泌的成熟体IL-1β也减少（P＜0.05）。见表1、图1。

2.2 白藜芦醇对炎症刺激下小胶质细胞的凋亡蛋白的影响 通过检测原代小胶质细胞中凋亡相关蛋白发现,与空白组比较,LPS+ATP诱导了小胶质细胞的凋亡反应,表现为BCL-2的显著降低（P＜0.01）,BAX水平的显著升高（P＜0.01）。而提前预给白藜芦醇,LPS+ATP+白藜芦醇组与LPS+ATP组比较,改善了LPS+ATP引发的细胞凋亡现象,BCL-2升高（P＜0.05）,BAX水平降低（P＜0.05）。见图2、表2。

表1 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表达的影响（， n=4）

表1 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表达的影响（， n=4）

注：与空白组比较,##P＜0.01；与LPS+ATP组比较,*P＜0.05。

图1 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表达的影响（， n=4）

图2 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞BAX、BCL-2表达的影响（， n=4）

2.3 白藜芦醇对炎症刺激下小胶质细胞凋亡的影响 细胞发生凋亡时,染色质有固缩现象,经Hoechst染色后,在荧光显微镜下观察,正常细胞细胞核呈蓝色,而发生凋亡细胞的细胞核会呈现致密浓染,蓝色较淡。在本研究中,小胶质细胞在LPS+ATP刺激下染色质有固缩现象且细胞核蓝色较浅,与空白组比较,细胞发生凋亡损伤（P＜0.01）,而提前预孵育白藜芦醇后,LPS+ATP+白藜芦醇组与LPS+ATP组比较明显改善了凋亡现象（P＜0.01）。提示白藜芦醇可改善由LPS+ATP引起的细胞凋亡损伤。见图3、表3。

表2 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞BCL-2、BAX表达分析的影响（， n=4）

表2 白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞BCL-2、BAX表达分析的影响（， n=4）

注：与空白组比较,##P＜0.01；与LPS+ATP组比较,*P＜0.05。

表3 Hoechst染色分析白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞凋亡的影响（， n=4）

表3 Hoechst染色分析白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞凋亡的影响（， n=4）

注：与空白组比较,##P＜0.01；与LPS+ATP组比较,**P＜0.01。

图3 Hoechst （×100）染色分析白藜芦醇对LPS+ATP模型原代小胶质细胞凋亡的影响（， n=4）

3 讨论

帕金森病是由多种环境因素、生物因素介导的慢性神经退行性疾病,在65岁以上老年人群中患病率达2%～3%,其主要特征为黑质致密部多巴胺能神经元的丢失与路易小体的沉积［8］。随着帕金森病进程的不断加深,临床症状常表现为运动迟缓加剧,脑内基底核、海马等多个脑区神经受损,并伴有严重的抑郁症状与非运动症状［9］。

目前关于帕金森病的治疗主要包括药物治疗、手术治疗、心理疏导等方面。其中药物治疗是帕金森病主要的治疗方式。临床上主要是通过药物以达到多巴胺替代来缓解症状的目的。然而,长期服用左旋多巴和多巴胺受体激动剂会出现异动症等不良反应［10］。由于帕金森病致病机制的多样性与临床病理表现的复杂性,单一的靶点药物已不能有效地缓解其病症,因而亟待研发安全性高、多靶点的活性药物来治疗帕金森病。

由于目前药物治疗存在“剂末效应” 等多种不良反应,开发多靶点安全性高的药物用于临床治疗。与现代药理学相比,传统医药具有多靶点以及整体调节等作用,白藜芦醇具有抗炎抗氧化对代谢性疾病和神经退行性疾病都有相应的治疗作用。基础研究中报道：在机体受损的细胞中,白藜芦醇可通过激活PI3K/AKT （磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B）信号通路,下调凋亡相关蛋白BAX的表达［11］。在本研究中,课题组使用LPS+ATP建立小胶质细胞炎症模型,探讨白藜芦醇改善炎症效应的机制。

近年来,随着基础研究的不断深入,人们对小胶质细胞在介导中枢神经炎症中的作用了解也不断加深［12-13］。小胶质细胞是脑内的重要免疫调节细胞,对维持中枢神经系统稳态和神经元的发育成熟等起着关键作用。静息状态下,小胶质细胞呈现细长的突触,而一旦接受危险信号刺激后,由静息态转变成活化的小胶质细胞,激活的小胶质细胞会引发大量促炎因子的产生诱导自身的凋亡反应,破坏脑稳态的平衡［14-15］。研究表明,小胶质细胞表面的多种模式识别受体是介导炎症反应的主要执行者,其TLRs （Toll样受体）家族在调节炎症反应中起到关键作用,通常TLR4与危险相关分子模式或病原相关分子模式结合后,激活下游NF-κB通路,促进pro-caspase-1 （caspase-1前体蛋白）与Pro-IL-1β （白细胞介素前体-1β）的转录和炎症小体的组装等,后CASPASE1 （半胱天冬酶1）切割诱导成熟IL-1β的产生参与神经损伤作用［16-18］。本实验表明白藜芦醇抑制了小胶质细胞中TLR4受体的表达,从而减少了NF-κB的激活,下游炎症相关蛋白转录减少,从而抑制了炎症因子IL-1β 的生成。

Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类：一类是具有抑制凋亡作用,Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白,其表达量上调可抑制细胞的凋亡；一类具有促进凋亡作用,Bax则是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白,其表达量上调可促进细胞的凋亡。Bax受细胞凋亡信号的影响,可在线粒体膜上产生蛋白孔道,释放线粒体内的细胞色素C,激活线粒体通路下游caspase家族蛋白酶的级联反应,从而调控细胞的凋亡［19-21］。研究表明,基于细胞炎症反应的治疗可改善细胞的凋亡损伤水平。本研究中,在小胶质细胞中提前预孵育白藜芦醇改善了LPS+ATP引发的细胞凋亡现象,逆转了BCL-2的降低与BAX水平的升高的现象。同时Hoechst染色发现,提前预孵育白藜芦醇后改善小胶质细胞的细胞核致密浓染,蓝色较淡的现相,提示白藜芦醇改善了小胶质细胞凋亡现象。

综上所述,白藜芦醇可能通过抑制TRL4/NF-κB/IL-1β信号通路改善了帕金森病中小胶质细胞炎症诱发的细胞凋亡现象,同时这一研究成果可结合相应的临床分析数据,以期为后续靶向小胶质细胞药物的开发提供理论基础。