贺 丰，朱立国*，赵 赫，付玲玲，李学朋

（1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.清华大学材料学院，北京 100084；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

神经根型颈椎病是一种较为常见的神经系统功能障碍性疾病,常由颈部脊髓神经根受到机械压迫或因神经根周围组织受损释放炎性因子刺激导致,如间盘退变椎间孔变窄、椎间关节活动度减小、钩突关节增生等［1］。Radhakrishnan等［2］研究表明50～54岁年龄组每10万人的年发病率最高可达202.9,随着电脑、智能手机的普及和伏案工作时间增长,发病率逐渐增高,而且发病年龄逐渐年轻化。中医学认为本病属于“项痹” 范畴,内因气血不足,不能濡养筋骨,外加劳累,起居不慎,风寒湿邪入侵,壅闭经络,导致气血凝滞、经络不通而产生疼痛、麻木等症状［3］。神经根型颈椎病以上肢疼痛,受累神经根支配区域感觉异常、肌力减退甚至肌肉萎缩为典型症状,严重影响人们的生活质量。其治疗方法主要以非手术疗法为主,西医包括颈部制动、牵引、理疗、抗炎、神经根脱水、硬膜外激素注射等［4］。而中医治疗神经根型颈椎病具有独特优势,包括针灸、手法、拔罐、中药外敷、小针刀、中药方剂辨证施治等。其中,辨证后使用方剂治疗神经根型颈椎病是一种别具特色且效果良好的方法。

行气活血通络方,是中国中医科学院望京医院院内制剂,由三七、川芎、延胡索、秦艽、独活、桂枝、葛根、威灵仙、当归、白芍、地龙11味中药组成,具有活血通络、行气止痛之效。其中,川芎、延胡索活血行气、散郁止痛共为君药。白芍,养血合营、缓急止痛；当归、地龙补血活血、通经活络,主肢体麻木,半身不遂；桂枝、葛根温经通脉,善治颈项肢节强痛,上5味共为臣药。秦艽、威灵仙、独活祛风除湿,和血舒筋,通络止痛,主风湿痹痛,肢麻筋挛,头项难伸共为佐药；三七活血消肿、祛瘀止痛为使药。诸药合用化瘀行气、通络止痛,治疗神经根型颈椎病临床效果显著。目前的研究多通过临床疗效或动物实验探讨行气活血通络方作用机制,对其药效物质基础及分子水平作用机制等方面研究尚不明确。并且由于复方中药活性成分多样,可作用于不同靶点,所以用常规方法来描述此方治疗神经根型颈椎病药理学机制则显得比较困难。

网络药理学是基于药物通过“多靶点、多途径、多通路” 发挥作用的理念而发展起来的新方法［5］,它可整合各种药物、蛋白、基因等数据库,采用生物信息学技术分析和构建药物-靶点-疾病的网络相互作用模型,探索药物发挥作用机制,其整体性、系统性的特点非常适合应用于中药及中药复方的研究。本研究采用网络药理学方法对行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的机制进行探讨,并为中药复方的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 行气活血通络方所含成分的收集与筛选 行气活血通络方由11味中药组成,分别是三七、川芎、延胡索、秦艽、独活、桂枝、葛根、威灵仙、当归、白芍、地龙。通过国内外文献调研和中药系统药理学数据库分析平台TCMSP （https：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集以上11味中药的活性成分,因地龙未在TCMSP中收录,因此通过BATMAN-TCM （http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库检索其活性成分,然后将地龙活性成分输入TCMSP数据库进行检索,最后以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30% 和类药性 （drug-likeness,DL）≥0.18［6］为限定条件对所有活性成分进行筛选。

1.2 行气活血通络方成分靶点预测 通过TCMSP数据库检索“1.1” 项中筛选出的活性成分的相关蛋白靶点,由于检索到的蛋白靶点存在命名不规范的问题,因此使用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）中的UniprotKB搜索功能,通过输入靶点名称并设定物种为人,将检索到的所有靶点蛋白校正为其官方基因名称（Official Symbol）。

1.3 神经根型颈椎病相关基因靶点的筛选 通过GeneCards数据库 （http：//www.genecards.org,Version 4.5.0）、OMIM数 据 库 （https：//omim.org/）和DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org）检索与神经根型颈椎病相关基因。因为神经根型颈椎病属于周围神经损伤,为了使结果更加全面准确,因此分别使用检索词peripheral nerve injury、cervical radiculopathy进行检索,获取与神经根型颈椎病相关基因。

1.4 行气活血通络方活性成分靶点与神经根型颈椎病相关靶点相互作用网络构建与分析 利用R语言韦恩图将行气活血通络方活性成分靶点基因与神经根型颈椎病相关基因进行合并,交集的部分很有可能是行气活血通络方活性成分治疗神经根型颈椎病的靶点基因。将交集基因及与之对应化合物导入Cytoscape 3.6.0软件构建行气活血通络方活性成分-作用靶点网络,并对网络进行分析,保存网络分析结果。在网络中,用节点（node）表示成分和靶点,用边（edge）表示成分与靶点之间的相互作用。

1.5 蛋白相互作用网络构建与分析 STRING数据库（https：//string-db.org,Version 10.5）［7］是一个收集了大量蛋白相互作用关系的数据库,其中包含了经过实验验证和通过生物信息学方法预测得到的数据,共涉及9 643 763个蛋白,1 380 838 440个相互作用。将行气活血通络方活性成分作用的蛋白靶点导入STRING数据库,限定物种为人,获取蛋白相互作用关系,结果保存成TSV格式,导入Cytoscape 3.6.0软件绘制相互作用网路。首先对此蛋白互作网络进行总体分析,然后使用Cytoscape 3.6.0软件中的cytohubba插件确定最重要的10个蛋白互作关系,计算方法的选择最大团中心性（maximal clique centrality,MCC）［8］。

1.6 GO分析与KEGG通路分析 Metascape数据库（http：//metascape.org）可为大规模的基因或蛋白提供系统综合的生物功能注释信息,能够找出最显著富集的生物学注释［9］。将行气活血通络方的作用靶点导入Metascape数据库,Input as species和Analysis as species均设置为H.sapiens,选择自定义分析（Custom Analysis）中的富集（Enrichment）,分别对GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway进行富集分析（Enrichment Analysis）,保存结果,筛选排名靠前条目。GO分析用GraphPad Prism 7.0软件绘制条形图、KEGG Pathway,用R语言绘制气泡图。

2 结果

2.1 行气活血通络方成分的收集与筛选 通过TCMSP数据库,以OB≥30%和DL≥0.18为参数收集行气活血通络方中符合条件的活性成分,结果三七8种、川芎8种、延胡索49种、秦艽2种、独活9种、桂枝7种、葛根4种、威灵仙7种、当归2种、白芍13种；地龙在BATMAN-TCM数据库中检索到8种活性成分,代入TCMSP数据库后,满足筛选条件的1种。所有化合物去重后共得到93种活性成分。

2.2 行气活血通络方靶点预测 通过TCMSP数据库检索行气活血通络方所含93种活性成分,结果得到出784个靶点,其中三七54个、川芎45个、延胡索215个、秦艽40个、独活92个、桂枝52个、葛根69个、威灵仙53个、当归70个、白芍90个、地龙4个。去重后共得到250个靶点,通过UniProt数据库将靶点蛋白转换为官方名称（Officical Symbol）。

2.3 神经根型颈椎病相关基因靶点筛选 在数据库中以peripheral nerve injury、cervical radiculopathy进行检索后,分别获得5 025、79个相关基因靶点,删除重复后共得到5 041个神经根型颈椎病相关基因。

2.4 行气活血通络方活性成分-作用靶点网络互作 将“2.2” “2.3” 项中的基因进行映射对比,发现213个共同基因,见图1,推测这些可能为行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的基因靶点。将交集基因靶点与对应活性成分输入Cytoscape 3.6.0软件构建行气活血通络方活性成分-作用靶点网络,见图2。图中共涉及303个节点,1 239条边,其中菱形节点代表行作用靶点,圆形代表活性成分,边代表活性成分和作用靶点间的相互关联。从图中可看出同一靶点可对应于不同的活性成分,同一活性成分也可对应于不同的靶点,体现了行气活血通络方多成分、多靶点的作用特点。其中川芎、延胡索共有成分槲皮素（quercetin/133个靶点）,白芍独有成分山柰酚（kaempferol/52个靶点）,葛根独有成分芒柄花黄素（formononetin/34个靶点）是作用靶点最多3种化合物。β-谷甾醇（beta-sitosterol/33个靶点）作用靶点数目排名第4,但当归、白芍、独活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威灵仙8味药中都含有此种成分。因此,上述4种化合物可能是此方剂中比较重要的活性成分。

2.5 蛋白相互作用网络构建与分析 蛋白互作网络结果见图3,图中节点表示蛋白,边表示蛋白之间的关联,共涉及210个节点,3 721条边（其中ADH1C、ATP5F1B未在数据库中找到,EIF6与其他蛋白没有相互作用,这3个蛋白不在相互作用网络中体现）。使用cytohubba插件中MCC方法计算后,确定最重要的10个蛋白互作关系,结果见图4。

图1 行气活血通络方化合物相关靶点与神经根型颈椎病相关靶点映射

图2 行气活血通络方“活性成分-靶点” 相互作用网络图

图3 蛋白互作网络

2.6 基因功能分析 使用Metascape数据库对行气活血通络方活性成分对应靶点进行GO分析,并筛选靠前的生物学过程、分子功能和细胞组分,用GraphPad Prism 7.0软件绘图,见图5～7。

图4 10个最重要的蛋白互作关系

其中BP分析（图5）中排名靠前的有response to toxic（对有毒物质的反应,65个靶点/30.66%）、response to inorganic substance （对无机物的反应,61个靶点/28.77%）、cellular response to nitrogen compound （细胞对氮化合物的反应,59个靶点/27.83%）、cellular response to organic cyclic compound （细胞对有机环状化合物的反应,56个靶点/26.42%）、response to lipopolysaccharide （对脂多糖的反应,44个靶点/20.75%）等生物学过程。MF分析（图6）排名靠前的的有neurotransmitter receptor activity （神经递质受体活性,22个靶点/10.38%）、kinase binding （激酶结合,39个靶点/18.4%）、G protein-coupled amine receptor activity（G蛋白偶联胺受体活性,15个靶点/7.08%）、transcription factor binding （转录因子结合,35个靶点/16.51%）、protein domain specific binding （蛋白域特异性结合,34个靶点/16.04%）等分子功能。CC分析（图7）排名靠前的有membrane raft （膜筏,31个靶点/14.62%）、postsynaptic membrane （突触后膜,26个靶点/12.26%）、dendrite （树突,32个靶点/15.09%）、receptor complex （受体复合物,26个靶点/12.26%）、vesicle lumen （囊腔,19个靶点/8.96%）等细胞组分。

图5 GO分析生物学过程

图6 GO分析分子功能

图7 GO分析细胞组分

2.7 KEGG通路分析 使用Metascape数据库对行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的213个靶点进行KEGG通路分析,根据LogP值筛选靠前的10个代表性通路见图8。图中节点的颜色从绿到红反应了LopP值从大到小,节点从小到大反应了相关基因数量的从少到多。结果显示,行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的机制主要涉及AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Pathways in cancer、TNF signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、HTLV-I infection、MAPK signaling pathway、Platinum drug resistance、cAMP signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Amoebiasis等通路。因此推测行气活血通络方治疗神经根型颈椎病可能与上述通路关系密切。

3 讨论

神经根型颈椎是颈椎病分型中的一种,以放射性上肢疼痛麻木或上肢感觉、运动功能障碍为主要表现。中药治疗颈椎病一般采取祛风散寒、活血行气、化痰祛湿、补益肝肾、通络止痛等治疗方法。行气活血通络方,是中国中医科学院望京医院院内协定方,由三七、川芎、延胡索、秦艽、独活、桂枝、葛根、威灵仙、当归、白芍、地龙11味中药组成。方中川芎、延胡索活血行气、散郁止痛共为君药。白芍,合营止痛；当归、地龙活血通络；桂枝、葛根温经通脉,上5味共为臣药。秦艽、威灵仙、独活祛风除湿,通络止痛,共为佐药；三七活血消肿、祛淤止痛为使药。诸药合用活血行气、通络止痛,临床采用此方加减治疗神经根型颈椎病具有良好疗效,以此方为基础化裁出的颈痛颗粒,已经批准上市用于治疗神经根型颈椎病［10］。但行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的药理学机制尚不明确。

图8 行气活血通络方治疗神经根型颈椎病相关靶点KEGG通路富集

本研究利用网络药理学方法从行气活血通络方所含11味中药中,筛选出93种活性成分,250个基因靶点,其中有213个基因与神经根型颈椎病相关,构建行气活血通络方活性成分-作用靶点网络图,有303个节点,1 239条边。显示了行气活血通络方多成分、多靶点共同作用治疗神经根型颈椎病的特点。其中槲皮素是行气活血通络方中君药川芎、延胡索的共有成分,拥有133个作用靶点在所有化合物中排名第1。臣药白芍的化合物山柰酚、葛根的化合物芒柄花黄素分别作用于52、44个靶点位列第2、3位,间接说明了君、臣药在此方中的重要作用。而第4位的β-谷甾醇（beta-sitosterol/33个靶点）是当归、白芍、独活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威灵仙8味中药的共有化合物,说明此方剂组合可产生一定的协同作用。以上两点可反应此方配伍较为科学合理。槲皮素是一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物,目前已经发现它具有多重生物活性,如抗氧化、抗病毒、抗炎作用［11］。Lazo-Gomez等［12］研究表明,槲皮素可通过活化sirtuin 1 （去乙酰化酶）防止慢性兴奋毒性刺激引起的脊髓运动神经元退行性变。Chen等［13］研究表明槲皮素可通过调节与再生和营养支持有关的基因的表达,如增加环磷酸腺苷表达使神经细胞在外周神经轴突再生中的生长激活,促进轴突再髓化,运动神经传导速度加快,从而促进小鼠坐骨神经挤压损伤后运动和感觉功能的恢复。山柰酚是一种黄酮类化合物,具有明显的抗氧化和抗炎活性。Su等［14］研究表明,山柰酚通过抑制NADPH氧化酶和保护SHP-2 （酪氨酸磷酸酶）免受氧化失活抑制胶原诱导的血小板活化,这说明山柰酚具有预防和治疗血栓性血管疾病的治疗潜力。农药毒死蜱（Chlorpyrifos,CPF）,是一种潜在的食品污染物,会引起神经毒性,Hussein等［15］研究表明,山柰酚可能通过调节GSK3β-Nrf2 （糖原合成酶激酶3β-核因子E2相关因子）信号通路,抑制GSK3β 介导基因表达和诱导Nrf2在大脑组织表达,提高抗氧化酶活性和乙酰胆碱酯酶活性,起到对神经元损伤的保护作用。芒柄花黄素可抑制脑内炎症反应和氧化应激,从而起到对脑外伤大鼠的神经保护作用［16］。β-谷甾醇广泛地存在于多种植物的细胞膜中,药理活性多样,研究表明,β-谷甾醇可调控多种细胞信号通路,包括细胞周期、凋亡、增殖、存活、侵袭、血管生成、转移和炎症［17］。

蛋白相互作用网络结果显示行气活血通络方作用于神经根型颈椎病的靶点间存在着复杂的交互关系,而不是独立的发挥作用,网络中共有210个节点,3 721条边,经过计算后发现JUN （转录因子AP-1）、VEGFA （血管内皮生长因子A）、TP53 （肿瘤抑制蛋白）、AKT1 （蛋白激酶B）、MAPK1 （丝裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2 （细胞凋亡相关蛋白）、PIK3CG （磷脂酰肌醇3激酶）、IL-6 （白细胞介素6）、PTGS2 （前列腺素内过氧化物合酶）、MMP9 （基质金属蛋白酶9）等可能是行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的主要靶蛋白。GO富集分析发现,行气活血通络方治疗神经根型颈椎病主要涉及毒性反应、无机物反应、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机循环化合物的反应、脂多糖反应、细胞对药物的反应、细胞因子介导的信号通路、氧水平反应、类固醇激素反应、活性氧代谢等生物学过程；涉及神经递质受体的活性、激酶结合、G蛋白偶联胺受体活性、转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白异构化活性、核受体活性、突触后神经递质受体活性、受体调节活性、蛋白酶结合等分子功能；涉及膜筏、突触后膜、树突、受体复合体、囊泡腔、转录因子复合体、胞质核周区、细胞顶部、树突膜等细胞组分,是一个复杂的过程。

通过KEGG生物途径富集分析发现,有10条信号通路被显著富集。其中,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路,可诱导多种细胞内信号传导,包括凋亡、细胞存活、炎症和免疫Rothman等［18］研究发现大鼠颈背根神经节受压可产生疼痛,而TNF-α 抗体可阻断相关信号传导提高痛阈。NF-κB （nuclear factor-kappa B,NF-κB）是一个转录因子家族的通称,可调控涉及免疫、炎症和细胞存活的基因。Suzuki等［19］发现使用NF-κB拮抗剂可明显抑制大鼠受压背根神经节中转录激活因子3 （ATF-3）及降钙素基因相关肽（CGRP）基因表达,从而提高大鼠的机械性痛阈和热觉痛阈,同时也证明NF-κB可能是腰椎间盘突出引起的坐骨神经痛明确的治疗靶点。晚期糖基化终末产物与其受体（AGEs-RAGE）是一组特异性组合,AGEs的产生和蓄积是导致神经、血管等多组织器官损伤的重要病理基础［20］。AGEs与RAGE相互作用启动一系列受体信号转导途径,激发多种细胞因子的形成与释放,导致机体神经、血管的病理改变。AGEs与RAGE的相互作用还可导致氧化应激的发生,进而激活NF-κB。NF-κB的激活可以增加黏附因子、内皮素和促凝血组织因子等基因的表达,使血流调节受损,导致神经内膜血流灌注减少［21］。神经活性配体-受体相互作用是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合。涉及环境信息处理,信号分子间相互作用等功能。人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）是一种致病性逆转录病毒,除了成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）有关,它还与非肿瘤性慢性炎性疾病密切相关,Tax是此通路中一种病毒调控蛋白和转录辅助因子,可干扰与抗凋亡或细胞增殖相关的多个信号通路,Tax调控信号通路也可涉及到它的结合转录因子如NF-κB等［22］。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是一个高度保守的模块,参与细胞的增殖、分化和迁移等多种功能。Obata等［23］研究表明MAPK在初级传入神经的活化作用,可能与炎症诱导的神经根病变的病理生理机制相关,初级传入神经中的MAPK通路,可能是背根神经节体细胞附近由炎性引起的神经病理性疼痛潜在的药物干预靶点。环腺苷酸信号通路（cAMP signaling pathway,cAMP）是最常见、最普遍的第二信使之一,它的形成是由腺苷酰环化酶（AC）在G蛋白偶联受体（GPCRs）被激素、神经递质等信号分子配体连接后激活而促进的。细胞内cAMP水平的改变会影响细胞内信号转导通路,进而调节蛋白活性、基因表达和细胞功能,进而调节细胞代谢、生长、分化和凋亡［24］。据报道［25］,神经组织中cAMP水平的升高不仅有助于减少SCI后的继发性病理反应,还能促进神经再生。Yang等［26］研究表明,补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤后红核神经元的神经保护具有协同作用,其机制可能与上调cAMP水平、激活cAMP/CREB/RhoA信号通路、促进神经生长因子表达有关。此外癌症、阿米巴病、铂耐药3个信号通路也富集了较丰富的基因,这3条通路参与细胞的增殖、分化、运动、迁移,还与炎性反应、血管的生成、细胞凋亡等多种生物功能相关。因此推断行气活血通络方可能通过以上通路发挥治疗神经根型颈椎病的作用。

综上所述,本研究利用网络药理学方法对行气活血通络方治疗神经根型颈椎病的机制进行探讨,发现此方包含多种活性成分,涉及多种信号通路和生物过程,体现了“多成分-多靶点-多途径发挥作用的特点。以期为研究行气活血通络方治疗作用的分子机制及药理学机制奠定基础,同时也为其他复方中药的研究提供思路和方法。