于迎春，赵 阳，梁素萍，郑景辉

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁 530001）

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种进行性、多灶性神经退行性疾病,约1% 的60岁以上人群受其影响［1］,其发病率随年龄增长逐渐升高。目前,PD的病因未明,其具体发病机制尚不明确,主要认为与神经炎症、氧化应激、基因突变、免疫学异常、细胞凋亡、线粒体损伤等有关［2-4］。临床上PD最常用的治疗方案是多巴胺替代疗法,但只控制临床运动症状,不能阻止疾病的进展,且长期的药物治疗可能导致严重的、不可逆的运动并发症。其他治疗方法主要包括外科治疗,如毁损手术、脑深部剌激等,干细胞疗法［5］,中医针灸、运动疗法、音乐疗法等辅助疗法治疗PD,但均不可以彻底治愈。

山茱萸-肉苁蓉药对来源于地黄饮子,出自于《黄帝内经·素问·宣明论方》,为补肾化痰名方,具有滋阴、补阳、开窍化痰之功效,山茱萸、肉苁蓉阴阳并补,共为君药,两药相使为用,发挥功效,其中山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱等功效,现代药理学研究表明其具有明显的抗氧化、抗炎杀菌、降血糖等功效。肉苁蓉具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效,现代药理学研究表明肉苁蓉具有神经细胞保护、抗氧化、抗衰老、调节免疫等作用。目前山茱萸-肉苁蓉药对在临床治疗帕金森病中广泛应用,但其治疗帕金森的确切机制尚不明确,本研究采用网络药理学的方法,通过相关数据库对山茱萸-肉苁蓉药对所包含的有效成分及作用靶点进行筛选,并将其靶点与帕金森疾病靶点进行匹配,筛选出山茱萸-肉苁蓉治疗PD相关的关键作用靶点,并进一步分析其治疗PD的物质基础和作用机制。

1 材料与方法

1.1 山茱萸与肉苁蓉药物成分信息获取及整理 使用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）收集中药山茱萸、肉苁蓉的化合物,并以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、类药性（drug likeness,DL）≥0.18,因有研究发现帕金森病患者血脑屏障受损［6］,故设定血脑屏障通透性（BBB）≥-0.85,为限定条件对所收集到的化合物进行筛选,将最终筛选出的化合物建立有效化合物数据库。

1.2 山茱萸-肉苁蓉药对作用靶点的预测 运用中药分子机制生物信息学分析工具（a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine,BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index）对运用TCMSP筛选出的山茱萸-肉苁蓉药有效化合物作用靶点进行预测。

1.3 有关帕金森病相关基因筛选 将 “Parkinson’ s disease” 作为检索词,通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）检索帕金森病相关靶点。GeneCards数据库通过Gifts算法,能够准确计算靶点与疾病的相关度,并按照相关度进行评分排序。本研究选取其中最低分超过20分的前237位靶点进行研究,其中最高分146.47分,并摘录相应的靶点的标准基因名。

1.4 山茱萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点的预测及PPI网络构建 首先将预测所得的山茱萸-肉苁蓉药对作用靶点与筛选出的帕金森相关发病靶点导入VENNY2.1 （http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）,得出两者共同靶点,即可能作用于帕金森病的靶点。后将所得共同靶点与其化合物相对应,使用Cytoscape 3.6.1软件做出化合物-靶点图。并将山茱萸-肉苁蓉药对作用于帕金森病的靶点上传至STRING 10.5数据库中（https：//string-db.org）,选择研究物种为“Homosapiens” （智人）,设定靶点间最低联系分数为0.4分,隐藏无相互关联的靶点,获得靶点联系网络图,最后将该图导入Cytoscape 3.6.1软件中构建PPI网络图。

1.5 山茱萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点的GO分析和KEGG分析 将山茱萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）,选择其中分子功能（molecular function）、生物过程（biologica process）和细胞成分（cellular component）3项对山茱萸-肉苁蓉作用于帕金森病的靶点进行GO富集分析,筛选具有显著差异的生物过程及可靠的靶点通路,并且使用GraphPad Prism 7软件将GO富集分析满足P＜0.05的结果做成可视化条形图。选择KEGG进行靶点基因通路注释分析,将得到的结果且满足P＜0.05作为重要通路用 Omicshare （http：//www.omicshare.com/）制作成可视化气泡图。

2 结果

2.1 山茱萸-肉苁蓉活性成分的筛选通过TCMSP数据库检索山茱萸及肉苁蓉的所有化合物（截止时间至2018年12月）,并按照口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、类药性（drug likeness,DL）≥0.18和血脑屏障通透性（BBB）≥-0.85作为筛选条件,筛选获得山茱萸的潜在活性成分16种,肉苁蓉潜在活性成分6种,见表1。

2.2 山茱萸-肉苁蓉化合物作用靶点的预测 将山茱萸-肉苁蓉化合物的Pubchem Cid代码上传至BATMAN-TCM数据库平台,并设置相似性模型阀值为“Score cutoff=20”,得到各化合物所对应的潜在靶点,并按照返回靶点的得分顺序排列,选各化合物取前20个靶点,不足20全部纳入,并去除重复靶点后,最终得到山茱萸化合物作用靶点164个,肉苁蓉化合物作用靶点94个。

2.3 帕金森病发病靶点筛选 通过GeneCards数据库共检索“Parkinson’s disease”,共获得5 597个可能引起帕金森病相关的靶点,其中Synuclein Alpha类靶点相关度最高（146.47分）,本研究选取其中相关度得分≥20分的靶点,共筛选获得237个相关靶点。

2.4 山茱萸-肉苁蓉作用于帕金森病靶点预测 将将预测的山茱萸-肉苁蓉化合物靶点及筛选得出帕金森病相关基因靶点,全部以基因名格式导入VENNY2.1软件中,取两者的交集,得出19个化合物与疾病共同靶点,19个具体靶点信息见表2,得出的韦恩图如图1所示。

2.5 化合物-靶点网络图的构建 将山茱萸、肉苁蓉药对与其21种活性成分和19个关键靶点基因,导入Cytoscape

表1 山茱萸-肉苁蓉药对化合物

表2 山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病的关键靶点

3.5.1 软件构建山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病药物-化合物-靶点相互作用的可视化网络图,结果见图2。

结果显示,有效化合物中diop （邻苯二甲酸二异辛酯）、marckine （丁哌卡因）、quercetin （槲皮素）、yangambin （鹅掌楸树脂醇b二甲醚）、ethyloleate （NF）（油酸乙酯）、cornudentanone （角豆酮）、3,4-dehydrolycopen-16-al上述7种成分能与2个及以上的疾病靶点基因联系,可能是山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病的重要成分,可知山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病是多成分、多靶点共同作用。

2.6 关键靶点的PPI网络构建及分析 将山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病的19个靶点基因导入String数据库获取蛋白质相互作用关系,由String数据库得到靶点相互作用网络图,结果如图3所示,其中“边” 代表作用靶点之间的关联,节点代表作用靶点。图中共19个节点,70条边,平均节点度为7.73,平均局部聚类系数0.661。靶标均以圆形节点表示,靶标之间连线越粗说明在治疗帕金森病靶标网络中的该靶点越重要。

图1 韦恩图

图2 药物-化合物-靶点互作网络图

图3 山茱萸-肉苁蓉靶点的蛋白互作网络图

2.7 山茱萸-肉苁蓉对帕金森病作用 靶点的GO富集分析和KEGG通路富集分对山茱萸-肉苁蓉作用于帕金森的19个相关靶点通过David数据库进行分析,主要包括3方面,即生物过程、分子功能、细胞成分,取P（P＜0.05）值排列前15的条目所对应靶点具有的功能信息,使用GraphPad Prism 7软件将筛选的条目制作成可视化条形图,见图4。再对上述19个靶点进行KEGG通路富集分析,得到P＜0.05的通路有9条,通过Omicshare软件进行可视化分析,结果见图5。

图4 GO富集分析

图5 KEGG通路富集分析高级气泡图

4 讨论

研究发现山茱萸中主要含有环烯醚萜苷类、鞣质、黄酮、有机酸、多糖类等多种成分［7］。徐一达［8］最新研究发现山茱萸中的马钱苷不仅抑制PD小鼠纹状体内多巴胺和TH表达,也抑制小鼠黑质内小胶质细胞和星形胶质细胞的活性,使caspase-3、TNF-α 及其上游调控因子NF-κB、p38和c-Abl的表达下降,主要机制可能是马钱苷抑制胶质细胞的聚集及激活、抑制炎症因子的表达、通过c-Abl-p38-NF-κB通路来抑制细胞死亡,同时可以影响细胞的自噬来增强神经细胞的生存能力,进而起到治疗PD的作用。肉苁蓉含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、木质素类等多种成分,其有效成分可以产生抑制神经细胞凋亡、增强免疫、抗氧化、抗衰老等作用［9］。王虎等［10］研究肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型有保护作用,其作用机制为肉苁蓉提取物通过降低GADD153 （生长抑制DNA损伤基因153）蛋白的表达来实现。也有研究发现肉苁蓉提取物能抑制PD小鼠黑质中多巴胺能神经元的减少,并且减少细胞凋亡、降低Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白的比例［11］,也可通过抑制PD大鼠纹状体及海马的细胞外液中单胺类神经递质含有量减少,发挥治疗PD作用［12］。其中β-sitosterol为2种中药的共同有效成分,研究表明其可以影响凋亡、炎症、血管生成等多种信号通路,有着治疗PD的潜在作用［13］。

本研究使用网络药理学研究方法,筛选山茱萸-肉苁蓉有效化合物22种,并预测出这些化合物可能作用于帕金森病的19个靶点,包括多巴胺受体 （DRD2、DRD3、DRD4）、多巴胺转运体（SLC18A2、SLC6A3）,乙酰胆碱酯酶（ACHE）、血管紧张素转化酶 （ACE）、蛋白激酶（AKT1）、大麻素受体 1 （CNR1）、乙醇脱氢酶 1C（ADH1C）、5-羟色胺受体（HTR1A、HTR2A）、丁酰胆碱酯酶（BCHE）、超敏反应蛋白（CRP）等,各靶点间有很强的相互作用,主要涉及多巴胺能神经元功能、乙酰胆碱系统、炎症反应、神经毒性等生理病理改变。

帕金森病主要病理改变为黑质多巴胺能神经元变性死亡,而多巴胺作为脑内重要的神经递质,主要通过不同亚型的多巴胺受体调控人体运动功能、认知活动等生理或病理过程,其中DRD2表达神经元通路,起到调节运动的作用［14］；DR的含有量与树突棘密度相关,DA受体的激活可以调节轴突结构,维持大脑正常功能,DR通过调节神经递质释放、调节释放频率等调节神经元的兴奋性［15］；多巴胺转运体在多巴胺（DA）转运过程中发挥了关键作用,当这些信号通路的功能紊乱时可引起帕金森病,因此多巴胺受体、多巴胺转运体靶点为治疗帕金森病的主要靶点。SLC6A3基因编码的多巴胺转运体（dopamine transporter,DAT）在多巴胺（DA）转运过程中发挥了关键作用。ACE主要与血压调节有关,但有研究表明ACE抑制剂可增加纹状体多巴胺水平和减少神经元坏死,对PD模型有保护作用,也是潜在的抑郁治疗靶点［16］。最新研究表明血清BChE活性可作为PD生物标志物,与帕金森病也有密切关系［17］。CRP主要与炎症相关,而炎症反应与帕金森病的发病和发展具有密切相关性［18］。HTR1A在抑郁症及部分精神系统疾病的发病机制中起着重要的作用,可能是导致帕金森后期合并抑郁症的重要原因［19］。由此可以看出上述靶标主要与神经元功能、多巴胺受体及转运体、炎症等诸多因素相关,既说明帕金森病的致病因素复杂,又说明山茱萸-肉苁蓉药对通过调节巴胺能神经元功能和乙酰胆碱系统的功能、抑制炎症、减轻神经毒性等方面治疗帕金森病。

为了详细的探究山茱萸-肉苁蓉有效化合物成分治疗PD的生物学过程、分子功能、细胞成分和信号通路,将山茱萸-肉苁蓉与PD相关的19个基因进行GO分析和KEGG分析。

通过GO富集分析发现山茱萸-肉苁蓉药对治疗帕金森病主要生物过程（BP）与多巴胺分泌的调节、多巴胺代谢过程的调节、化学性突触传递、突触传递负调控、5-羟色胺受体信号通路、G蛋白偶联受体信号通路、细胞钙离子稳态、行为控制等主要生物过程相关。其中在多巴胺分泌的调节与多巴胺代谢过程的调节与治疗帕金森的相关机制密切相关,因帕金森病主要是多种原因导致多巴胺能神经元损伤、凋亡,最终纹状体内多巴胺浓度下降,导致大脑反馈调节失衡而发病。因此作用于多巴胺能系统的药物,可通过激动多巴胺受体、多巴胺转运体等可有效控制帕金森病［20］。在G蛋白偶联受体信号通路中,有研究发现在PD小鼠模型中,雷诺昔芬与G蛋白偶联雌激素受体30结合发挥抑炎作用,可抑制炎症通路,降低相关炎症因子水平,从而抑制PD的慢性炎症进展。表明G蛋白偶联雌激素受体（GPR30）参与雌激素在PD炎症中具有抗炎、神经保护等作用［21］。在5-羟色胺受体信号通路中,范玲玲等［22］研究发现5-HT7受体激动剂可能以多种方式调控着内侧前额叶皮层（mPFC）锥体神经元的电活动,且黑质纹状体通路的退化易导致mPFC锥体和中间神经元上5-HT7受体出现功能紊乱。这为5-HT7受体参与PD病人并发的抑郁、焦虑等症状提供了功能学和细胞学的解释,也为PD治疗开辟了新的研究方向。分析GO富集结果发现山茱萸-肉苁蓉的生物过程中主要与 DRD2、DRD3、DRD4、SLC18A2、SLC6A3、HTR1A、HTR2A基因相关,说明山茱萸-肉苁蓉可能通过对多巴胺受体、5-羟色胺受体这两个靶点来治疗PD。相关研究表明,HTR2A受体的拮抗剂在帕金森病模型上能够减轻左旋多巴所致药物不良反应［23］；部分DRD2激动剂不仅能改善PD的运动症状,且引起运动障碍和精神性疾病的副作用的概率较低［24］,说明中药在防治PD中有很好应用前景。

GO富集分析中分子功能涉及多巴胺的结合、多巴胺神经递质受体活性,通过Gi/Go耦合、多巴胺神经递质受体活性、酶的结合、乙酰胆碱酯酶活性、胆碱酯酶活性、胆碱结合等。GO富集分析中细胞成分主要涉及轴突、树突、（神经元的）突触、突触后膜、质膜、薄膜、膜筏等,主要涉及神经信号传递、神经元的组成及功能等。

通过基因KEGG通路富集分析得出山茱萸-肉苁蓉防治PD主要调控多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、缝隙连接、5-羟色胺能突触、信号通路、帕金森疾病等9条相关信号通路发挥作用,表明山茱萸-肉苁蓉化合物的作用靶点有多条通路,可通过各通路协调作用治疗帕金森病。在多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、信号通路这3条神经递质相关通路中,可能通过作用于多巴胺受体［25］、多巴胺转运体、大麻素受体1、5-羟色胺受体来治疗PD,也可能通过增加多巴胺神经元的数量,减轻黑质多-纹状体巴胺能通路的变性,维持多巴胺水平的稳定。

在cAMP信号通路中,环核苷酸（cAMP）作为中枢神经系统细胞的第2信使,对神经系统活动起调节作用,包括神经元的存活、树突和轴突的生长、神经元的发育和认知。Wu等［26］利用PD模型小鼠进行细胞试验发现,下调miR-200a可导致AKT、cAMP、PKA表达降低,而DRD2、CREB表达升高,说明下调miR-200a通过阻断cAMP/PKA信号通路,可增加DRD2表达,抑制纹状体细胞凋亡进而有效控制PD。韩雪峰等［27］研究发现上调cAMP信号通路可使列当中Crenatoside （黄药苷）对D-半乳糖诱导的PC12神经细胞损伤有明显的保护作用。山茱萸-肉苁蓉的有效化合物可通过调节神经元的发育、神经元的存活、树突和轴突的生长、保护受损神经等生理过程发挥治疗PD的功能。

在缝隙连接信号通路中,缝隙连接通道可通过对抗细胞间电阻,实现细胞间的兴奋传递。缝隙连接蛋白43（Cx43）是中枢神经系统（CNS）中含有量较多的连接蛋白,并以缝隙连接 （gap junction,GJ）和半通道（hemichannel,HC）的形式存在,并介导细胞内外的信息交流与细胞间的信息交流。大量研究表明Cx43GJ和HC的改变推进了神经退变疾病进程［28-29］；PD患者可因黑质胶质细胞激活,导致大量的促炎因子表达（如IL-1β、TNFα、INF-γ）,炎症因子最终导致星形胶质细胞Cx43GJ的改变加快PD患者病程进展［30］。研究发现［31］在PD动物模型中,总Cx43 mRNA水平与星形胶质细胞Cx43的免疫活性增加明显,表明Cx43HC活性增加与PD的发病相关。山茱萸-肉苁蓉药对的有效成分对PD的治疗可通过抑制促炎因子的表达,减少星形胶质细胞Cx43的改变而发挥作用。

综上,本研究使用网络药理学方法对山茱萸-肉苁蓉药对治疗PD的主要化合物、靶点、通路等进行详细分析,初步验证了山茱萸-肉苁蓉药对治疗PD的主要机制,为下一步进行深入研究其作用机制提供理论基础。本研究结论仅依靠网络药理学方法对相关数据库进行挖掘得出,虽然通过相关文献验证了结论的可靠性,但下一步仍需通过动物实验验证其主要作用机理,以期为临床治疗PD提供思路。