李祖成，王 月，赵 峰，王原超，杨 茗，李淑翠，王垣芳*

（1.滨州医学院基础医学院，山东烟台 264003；2.滨州医学院药学院，“方剂效应与临床评价”国家中医药管理局重点研究室，山东烟台 264003；3.滨州医学院临床医学院，山东烟台 264003）

疼痛是许多疾病的常见症状,也是机体在受到伤害性刺激或损伤时产生的一种保护性的病理反应。剧烈的疼痛不仅给患者造成痛苦,严重时可导致生理功能紊乱,甚至引起休克。目前临床应用的镇痛药主要包括非甾体类抗炎药和阿片类药物,非甾体类抗炎药主要适用于治疗轻、中度的慢性疼痛,但长期应用消化道不良反应发生率较高,有些新型的非甾体类抗炎药物甚至可引起严重的皮肤反应和急性心血管不良事件；阿片类镇痛药镇痛活性强,但因易导致依赖性、成瘾性,其临床应用受到严格限制,主要用于治疗急性剧烈疼痛和晚期癌症疼痛。因此,寻找和研发毒副作用小的镇痛药是多年来医药界关注的重要课题,从传统中药中寻找镇痛活性成分也成为近年来的热点之一。

中药鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草 （Commelina communisL.）的全草,其性寒,味甘、淡,具有清热解毒、利水消肿之功效,用于治疗跌打损伤、筋骨疼痛、小便淋漓作痛、风热感冒、高热不退、咽喉肿痛、痈肿疔毒等病症［1-2］。研究发现,鸭跖草中含有黄酮类、生物碱类、萜类、甾醇类等多种化合物［3-4］。但是对于鸭跖草镇痛作用有效部位及镇痛作用机制研究尚未见报道。本研究采用辐射热刺激甩尾法、醋酸扭体法观察鸭跖草不同提取部位对小鼠的镇痛作用,以探究其镇痛活性部位,并通过阿片受体阻断试验和检测疼痛部位组织中的炎症因子探讨其镇痛作用机制,旨在为鸭跖草的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级昆明种小鼠,雌雄各半,体质量（20±2）g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,实验动物生产许可证号 SCXK （鲁）20140007,动物合格证号37009200012102。动物适应性饲养3 d,实验药前及实验过程中均全价颗粒饲料喂养,自由饮水,昼夜明暗交替时间12 h/12 h,实验室温度为25 ℃,相对湿度为40%。

1.1.2 药物与试剂 鸭跖草（安徽易元堂中药饮片科技有限公司,批号20150410）；阿司匹林肠溶片（每片100 mg,石药集团欧意药业有限公司,批号286160208）；盐酸曲马多缓释片（每片100 mg,萌蒂［中国］制药有限公司,批号10100706,成人单剂量50～100 mg）；盐酸纳洛酮注射液（规格2 mL ∶2 mg,批号20150906,成都苑东药业有限公司）。小鼠组织前列腺E2（PGE2）酶联免疫检测试剂盒（批号20160530）、小鼠组织肿瘤坏死因子-α （TNF-α）酶联免疫检测试剂盒（批号20160530）和小鼠组织白介素-6（IL-6）酶联免疫检测试剂盒（批号20160530）,均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器 SW-200光热尾痛测试仪（成都泰盟科技有限公司）；BIO-RAD iMark酶标仪（美国BIO-RAD公司）；UV-1901台式高速微量离心机（北京科普顺科技有限公司）；AN1574电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；KQ-400数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法

2.1 鸭跖草不同提取部位的制备 称取鸭跖草4.5 kg,粉碎制成粗粉,浸泡2 h,以70%乙醇进行回流提取1 h,连续3次,将3次的提取液合并,回收溶剂,减压浓缩直至无醇味,干燥后得鸭跖草浸膏49.85 g。将浸膏按硅胶与浸膏3 ∶1的比例混合搅匀,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水进行萃取,减压,干燥,直至无溶剂残留,得到石油醚提取部位（27.16 g）、乙酸乙酯提取部位（2.67 g）、正丁醇提取部位（7.28 g）和水溶部位（30 g）,计算各提取部位与生药的比值,临用前用蒸馏水配制成适当质量体积浓度的混悬液,置于冰箱4 ℃保存备用。

2.2 鸭跖草不同部位的镇痛作用

2.2.1 辐射热刺激甩尾法测定痛阈值［5］昆明种小鼠140只,雌雄各半,体质量（20±2）g,按性别分笼,每笼10只,自由采食饮水。小鼠在实验室适应7 d后,随机分为14组,即生理盐水组,盐酸曲马多组（0.013 g/kg）,鸭跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低剂量组 （30、15、7.5 g生药量/kg）,给各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,连续7 d。

灌胃给药前,将小鼠置入固定筒内,尾部暴露于外,实验前先用75%酒精擦净尾部,在尾部中下1/3处做标记作为光辐射刺激点,然后将尾部标记对准光热尾痛测试仪的光辐射孔,待小鼠安静后测定甩尾潜伏期（光强75%）3次,每次间隔5 min,取3次的平均值作为基础痛阈值。末次给药后1 h,测试各小鼠给药后的痛阈值。

2.2.2 醋酸扭体法测定痛阈值［5-6］昆明种小鼠140只,雌雄各半,体质量（20±2）g,按性别分笼,每笼10只,自由采食饮水。小鼠在实验室适应7 d后,随机分为14组,即生理盐水组,阿司匹林组（0.5 g/kg）,鸭跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低剂量组（30、15、7.5 g生药量/kg）,给各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,连续7 d。末次给药后1 h,给各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.4 mL,观察并记录各鼠扭体反应的潜伏期和15 min内扭体反应的次数。

2.3 鸭跖草镇痛有效部位的作用机制

2.3.1 阿片受体阻断试验 经过上述实验即可筛选出鸭跖草的镇痛活性部位为水溶部位。昆明种雌性小鼠,体重（22±2）g,采用热板法［5］（55±1）℃筛选痛阈值相近的小鼠30只,随机分为3组,即1组（生理盐水/纳洛酮组）、2组（鸭跖草水溶部位/生理盐水组）、3组（鸭跖草水溶部位/纳洛酮组）,每组10只。2、3组分别灌服鸭跖草水溶部位（相当于生药30 g/kg）,1组灌服等量的生理盐水,每天1次,连续7 d,末次给药45 min后进行如下处理。

鸭跖草水溶部位/生理盐水组：腹腔注射生理盐水0.1 mL/10 g进行预处理,15 min后再次灌服鸭跖草水溶部位；鸭跖草水溶部位/纳洛酮组：用纳洛酮0.1 mL/10 g（5 mg/kg）腹腔注射进行预处理,15 min后再次灌服鸭跖草水溶部位；生理盐水/纳洛酮组：腹腔注射生理盐水进行预处理,15 min后注射纳洛酮（剂量同前）；末次给药1 h后再次进行热板试验,记录舔后足潜伏期作为痛阈值（超过60 s者均按60 s计算）。

2.3.2 福尔马林致痛试验局部组织中炎症因子含有量测定

昆明种雌性小鼠,体质量（22±+2）g,随机分为6组,即生理盐水组,阿司匹林组（500 mg/kg）,盐酸曲马多组（0.013 g/kg）,鸭跖草水溶部位高、中、低剂量组（30、15、7.5 g生药量/kg）,每组10只,连续灌胃给药7 d。末次给药1 h后,于小鼠右足底皮下注射5%福尔马林25 μL,然后放置于悬挂的1 000 mL烧杯内,观察第一时相（0～10 min）和第二时相（15～30 min）舔咬右后足次数［5,7］。福尔马林试验结束后6 h,将小鼠颈椎脱臼处死,剪取肿胀右足底组织并称定质量,按质量容积比1 ∶9 （1 g ∶9 mL）的比例加生理盐水,研磨成匀浆,于4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液,ELISA测定PGE2、TNF-α 和IL-6含有量。

3 结果

3.1 鸭跖草不同部位的镇痛作用

3.1.1 鸭跖草提取部位对小鼠辐射热刺激痛反应的影响各给药组的给药前痛阈值（辐射热刺激甩尾潜伏期）与生理盐水组比较无显著性差异（P＞0.05）。与生理盐水组比较,阿司匹林组小鼠给药后痛阈值明显增大（P＜0.01）；与自身给药前及生理盐水组比较,鸭跖草石油醚提取部位高剂量组（30 g/kg）和水溶部位高、中、低剂量组（30、15、7.5 g/kg）痛阈值有不同程度增大 （P＜0.05,P＜0.01）,尤以水溶部位高、中剂量组最为显著（P＜0.01）。见表1。

3.1.2 鸭跖草不同提取部位对小鼠醋酸扭体反应的影响与生理盐水组比较,阿司匹林组小鼠扭体次数减少、扭体反应潜伏期延长（P＜0.01）；鸭跖草石水溶部位高、中、低剂量组小鼠扭体次数减少,扭体反应潜伏期延长（P＜0.05,P＜0.01）,其中水溶部位高、中剂量组扭体次数显著减少,扭体反应潜伏期显著延长（P＜0.01）,见表2。

3.2 鸭跖草镇痛有效部位的作用机制

3.2.1 纳洛酮对鸭跖草水溶部位镇痛作用的影响 鸭跖草水溶部位/生理盐水组小鼠给药后的痛阈值增大,即舔足潜伏期延长,与自身给药前基础痛阈值比较有显著性差异（P＜0.01）；与生理盐水/纳洛酮组比较有显著性差异（P＜0.05）；与鸭跖草水溶部位/生理盐水组比较,鸭跖草水溶部位/纳洛酮组小鼠舔足潜伏期缩短（P＜0.05）；与自身给药前基础痛阈值比较,鸭跖草水溶部位/纳洛酮组小鼠舔足潜伏期延长（P＜0.05）。见表3。

表1 鸭跖草不同提取部位对小鼠辐射热刺激痛反应的影响（， n=10）

表1 鸭跖草不同提取部位对小鼠辐射热刺激痛反应的影响（， n=10）

注：与生理盐水组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与自身给药前比较,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表2 鸭跖草不同提取部位对小鼠醋酸扭体反应的影响（， n=10）

表2 鸭跖草不同提取部位对小鼠醋酸扭体反应的影响（， n=10）

注：与生理盐水组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 纳洛酮对鸭跖草水溶部位镇痛作用的影响（，n=10）

表3 纳洛酮对鸭跖草水溶部位镇痛作用的影响（，n=10）

注：与生理盐水/纳洛酮/组比较,*P＜0.05；与鸭跖草水溶部位/生理盐水组比较,△P＜0.05；与自身给药前基础痛阈值比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.2.2 鸭跖草水溶部位对小鼠福尔马林致痛的影响 与生理盐水组比较,阿司匹林组小鼠在第一时相（0～10 min）舔咬右后足次数无明显减少 （P＞0.05）,在第二时相（15～30 min）舔咬右后足次数减少（P＜0.01）；盐酸曲马多组小鼠在第一相和第二相舔咬右后足次数均减少（P＜0.01）；鸭跖草水溶部位各剂量组小鼠在第一时相和第二时相舔咬右后足次数均减少（P＜0.01,P＜0.05）,且呈剂量依赖性。见表4。

表4 鸭跖草水溶部位对小鼠福尔马林致痛的影响（，n=10）

表4 鸭跖草水溶部位对小鼠福尔马林致痛的影响（，n=10）

注：与生理盐水组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

3.2.3 鸭跖草水溶部位对炎症因子的影响 与生理盐水组比较,阿司匹林组小鼠右足底局部组织PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）；鸭跖草水溶部位高、中剂量组小鼠右足底局部组织PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）,其中以高剂量组的含有量降低最明显（P＜0.01）,见表5。

表5 鸭跖草水溶部位对炎症因子的影响（， n=10）

表5 鸭跖草水溶部位对炎症因子的影响（， n=10）

注：与生理盐水组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 讨论

疼痛是机体受到伤害性刺激和发生炎症反应时所伴随的症状,一般分为急性伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经病理性疼痛［8］。一定强度的热刺激引起的疼痛为急性伤害性疼痛［6］。小鼠尾部对热刺激特别敏感,当受到一定强度的热刺激时,痛觉信号传导至神经中枢,再反馈到运动系统即可出现甩尾的保护性反应,因此热刺激时小鼠出现甩尾的潜伏期可反映痛阈值［5］。醋酸扭体法是通过给小鼠腹腔注射一定容积和浓度的醋酸,刺激腹膜引起炎性疼痛,从而出现扭体反应,该反应在注射15 min内出现频率最高,故以注射15 min内发生扭体反应的次数或发生反应的潜伏期作为疼痛指标［5,9］。

本实验结果表明,鸭跖草水溶部位可明显提高小鼠热刺激痛阈值,减少小鼠醋酸致痛的扭体反应次数；石油醚提取部位高剂量具有一定的提高痛阈值作用,而石油醚提取部位中、低剂量和乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位各剂量均无明显作用,提示鸭跖草的水溶性部位为鸭跖草的镇痛活性部位。

福尔马林致痛试验是目前国际公认的用于研究药物镇痛作用的常用方法［10］,适用于筛选镇痛作用较弱的药物,其致痛刺激较为持久,且疼痛反应的两个时相分别代表不同性质的疼痛。第一时相（0～10 min）反应为福尔马林直接刺激伤害性感受器,引起C纤维兴奋而出现急性伤害性疼痛,其特点为短暂的急痛反应,表现为舔足、缩足或抬足反射等行为反应；第二时相（15～30 min）反应则是由于第一阶段引起的中枢敏化和外周炎症共同参与所致［10-12］。本实验结果显示,鸭跖草水溶部位对小鼠福尔马林致痛试验的第一时相和第二时相反应均有抑制作用,提示鸭跖草水溶部位对伤害性刺激引起的急性伤害性疼痛和炎症反应引起的炎性疼痛均有抑制作用。

TNF-α、IL-6、PGE2是重要的致炎因子。组织损伤时,受损的组织细胞和免疫细胞可释放TNF-α、IL-6和PGE2等炎症介质,引起炎症反应和疼痛［13-15］；PGE2还可直接刺激痛觉感受器引起疼痛［6］。本实验结果显示,给小鼠足底注射福尔马林可引起局部组织中PGE2、TNF-α 和IL-6释放增加,表明注射部位发生了炎症反应；鸭跖草水溶部位能使局部组织PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低,且呈剂量相关性,提示鸭跖草水溶部位具有抑制炎症反应和减轻炎性疼痛的作用。

阿片受体是内源性阿片肽和阿片类药物产生镇痛作用的重要靶点。纳洛酮为阿片受体拮抗剂,可竞争性拮抗阿片肽和阿片类药物的镇痛作用［16-17］。本实验结果表明,纳洛酮能使鸭跖草水溶部位的镇痛作用有所减弱,提示鸭跖草水溶部位的镇痛作用机制可能部分与激动阿片受体有关。

本研究结果提示,鸭跖草的水溶部位为鸭跖草的镇痛活性部位,对于伤害性疼痛的镇痛作用可能与阿片受体有关；对于炎症性疼痛的镇痛作用可能与减少前列腺素等致炎因子有关。