张 凡 孟 莉 刘蓬蓬王 旭王 锐宋 成贾天柱*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600；2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连 116600）

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮。其味苦,性寒,归肾、膀胱、大肠经,具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效,为中医传统的清热燥湿药［1］。《本草纲目》 载有“黄檗性寒而沉,生用则降实火,熟用则不伤胃,酒炙则治上,盐炙则治下,蜜炙则治中”。这是对黄柏炮制作用最精辟的论述。生黄柏具苦寒之性,清热燥湿作用强,酒炙缓和苦寒之性,而盐炙则增强苦寒之性,又引药下行入肾,还可增强滋阴降火的作用。此外在其他医书中,针对黄柏的盐炙也有相关的记载。黄柏经盐炙后可引药下行入肾,其滋肾阴、泻肾火、退虚热的功效增强,可用于阴虚发热、梦遗滑精、骨蒸劳热、盗汗、咳嗽咯血等证。而目前黄柏的“盐炙入肾”的炮制理论仍然停留在传统表述之中,并无现代科研数据支撑。本实验通过大鼠肾组织中对黄柏有效成分的吸收差异,对其“盐炙入肾” 的理论进行验证［2］。

黄柏中富含生物碱类及少部分柠檬苦素类成分,其中生物碱类包含小檗碱、黄柏碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱等,这些都是黄柏中具有代表性的活性成分,具有清热、抗炎、降血压等功效［3］。此外,除生物碱成分,黄柏还含有少量的柠檬苦素类成分,如黄柏酮和黄柏内酯等［4］。本实验拟通过对黄柏生品及盐炙品的水煎液进行大鼠灌胃给药后,并分别在不同时间点摘取其肾组织,采用液质联用的方法对肾组织脏器中生物碱类成分进行含有量测定,从而分析黄柏生制品在肾组织脏器的吸收差异。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色谱串联飞行质谱仪 （美国Waters公司）；METTLER AE240型分析天平（十万分之一,瑞士Mettler公司）；FA1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；FSH-2可调高速电动匀浆器（江苏佳美仪器有限公司）；XW-80A涡旋混合器 （上海青浦沪西仪器厂）；Thermo Fisher Finnpipette Steppers单道连续分配移液器（芬兰雷勃公司）；HGC-12A氮吹仪（天津恒奥科技有限公司）；Milli-Q纯水仪（德国Millipore公司）。

1.2 试剂与药物 黄柏碱、木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、尼莫地平对照品（大连美伦生物技术有限公司,批号分别为M0107AS、M0717AS、B0613AS、S0913AS、J0918AS、M0503AS）；质谱级甲醇、乙腈、色谱级甲醇（美国Sigma公司）；水为超纯水,无碘盐（大连盐业有限公司）；其他试剂均为高级分析纯。

1.3 药材 黄柏药材采自四川省雅安市荥经县,经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮。

2 方法

2.1 实验动物 SD雄性大鼠66只,体质量180～200 g,6～8周龄,辽宁长生生物技术有限公司提供,许可证号SCXK （辽）2010-0001。在正式实验前,大鼠适应性喂养一周,预饲养期间自由饮食饮水,室温（22±2）℃,湿度（60±2）%。

2.2 黄柏生制炮制制备

2.2.1 生黄柏制备 取黄柏原药材,洗净,润透,切细丝,干燥,既得。

2.2.2 盐黄柏制备 取净制后的黄柏丝,放入适宜的容器中,加适量盐水拌匀,闷润2 h,待黄柏吸进辅料盐水后取出。在炒制容器内于150～160 ℃下,炒制6 min,取出,放凉,即得。每100 g黄柏加2 g盐,30%蒸馏水［5］。

2.3 给药水煎液制备 分别取黄柏生品和盐炙品适量置于煎药锅中,先加入10倍量水浸泡30 min,而后煎煮60 min,滤过；此后药渣再加入8倍量水,再次煎煮60 min,滤过。合并2次滤液,水浴浓缩至质量浓度为1 g/mL［6-7］。

2.4 给药方案及样品采集 66只大鼠随机分成2组,分别为生黄柏组30只,盐黄柏组30只,空白组6只。各组给药体积为10 mL/kg,灌胃给予相应黄柏炮制品药液。分别于0.5、1、3、6、9 h时间点上,每组脱颈椎处死6只动物,立即取出肾脏组织,生理盐水冲洗干净,用滤纸吸干表层水分,分装于自封袋中,置-80 ℃冰箱中保存待测。

2.5 溶液制备

2.5.1 对照品溶液 精密称取黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱对照品适量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制备成质量浓度分别为74.8 μg/mL的黄柏碱、63.4 μg/mL的黄柏碱、63.2 μg/mL的药根碱、60.1 μg/mL的巴马汀、61.2 μg/mL的小檗碱对照品贮备液,置于冰箱中4 ℃保存备用。

2.5.2 内标溶液 精密称取尼莫地平对照品适量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制备成质量浓度为5.0 μg/mL的内标溶液,并置于4 ℃的环境中保存备用。

2.6 肾组织样品处理 精密称量肾组织样品200 mg,剪碎后,加入2 mL生理盐水,用组织匀浆机处理。之后以4 000 r/m离心,取上清组织匀浆液100 μL,加内标溶液10 μL,涡旋混合30 s,再加入乙腈400 μL,涡旋混合180 s,12 000 r/m离心10 min后,取上清液。将上清溶液,于35 ℃氮气吹干,残渣加入乙腈-水（1 ∶1）混合溶液100 μL复溶,涡旋混匀3 min进行混匀,最后以12 000 r/m冷冻离心5 min,取上清液5 μL进样分析［8-9］。

2.7 分析条件

2.7.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸水（A）-0.1% 甲酸乙腈（B）,梯度洗脱,程序见表1；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.7.2 质谱条件 采用ESI源；正离子MRM模式检测；离子源能量3.0 kV,采样锥电压50 V,离子源温度150 ℃,脱溶剂温度450 ℃；锥孔气体体积流量50 L/h,脱溶剂气体体积流量900 L/h。

2.8 分析方法确证

2.8.1 专属性试验 黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱和内标物尼莫地平成分在ESI正离子电离方式下,主要生成［M+H］+离子峰,分别为m/z342.17,m/z342.18,m/z338.15,m/z352.15,m/z336.07,m/z419.21。选择性对［M+H］+离子进行产物离子全扫描质谱分析,上述指标性成分和内标物的主要碎片离子分别为m/z192.15,m/z265.16,m/z323.03,m/z336.20,m/z320.29,m/z343.17,并将这些主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子（MRM模式）,各检测成分的母离子和产物离子见表2。

表2 MRM模式下各检测成分和内标物的母离子和产物离子Tab.2 Optimized multiple reaction monitoring parameters for analytes and internal standard

分别取大鼠空白肾脏组织匀浆液及给药后肾组织样品100 μL,按“2.6” 项下方法操作,得到MRM色谱图,见图1。由图可见,黄柏给药后指标性成分和内标物成分出峰保留时间分别为黄柏碱1.02 min、木兰花碱1.10 min、药根碱2.42 min、巴马汀3.69 min、小檗碱4.15 min、尼莫地平7.05 min,各组分色谱峰之间分离良好,表明组织中内源性物质对所测定成分无干扰［10-11］。

图1 黄柏中生物碱及内标物生物样品质谱TIC图Fig.1 TIC spectrum of alkaloids and internal standard biological samples in P.chinense

2.8.2 线性关系及定量下限

2.8.2.1 线性关系考察 取大鼠空白肾脏组织匀浆液100 μL,加内标溶液和黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱系列溶液,分别制备成黄柏碱组织质量浓度分别为3.74、7.48、14.96、24.93、59.88、119.76、239.51、437.03 ng/mL；木兰花碱组织质量浓度分别为15.85、31.70、63.40、126.80、253.60、507.20、1 014.40、2 028.80 ng/mL；药根碱组织质量浓度分别为15.80、31.6、63.20、126.40、252.80、505.60、1 011.20、2 022.40 ng/mL；巴马汀组织质量浓度分别为15.02、30.04、60.08、120.16、240.32、480.64、961.28、1 922.56 ng/mL；小檗碱组织质量浓度分别为15.30、30.60、61.20、122.40、244.80、489.60、979.20、1 958.4 ng/mL；内标尼莫地平溶液质量浓度相当于500 ng/mL的标准样品,按“2.6” 项下方法处理,记录色谱图；以待测物指标性成分质量浓度为横坐标（X）,待测物与内标物的面积比为纵坐标（Y）,用加权（w=1/x2）最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程,结果表明各成分在各自范围内线性关系良好。结果见表3。

2.8.2.2 定量下限 取大鼠空白肾脏组织匀浆液100 μL,加入对照品溶液制备成3.74 ng/mL黄柏碱、15.85 ng/mL木兰花碱、15.80 ng/mL药根碱、15.02 ng/mL巴马汀、15.30 ng/mL小檗碱溶液,按“2.6” 方法操作,并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度,考察定量下限。结果见表3。发现上述各浓度对照品的准确度偏差在±20% 以内,精密度RSD≤15%［12］。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.8.3 精密度和准确度试验 取空白肾组织匀浆样品100 μL,按“2.8.2” 项下方法制备低、中、高3个浓度的质量控制样品,每一浓度平行分析6份,连续测定3 d,根据质量控制样品测定的结果计算本方法的准确度与精密度,结果表明,样品日内、日间精密度RSD均小于15%,准确度均在±15%的范围之间,表明该方法准确度与精密度良好。

2.8.4 提取回收率和和基质效应

2.8.4.1 提取回收率 取空白肾组织匀浆液100 μL,按 “2.8.3” 项下方法操作,制备低、中、高3个浓度的质量控制样品,每个浓度平行测定6份,记录色谱峰,测定各组分和内标物的峰面积记为A。同时另取空白肾组织匀浆液100 μL,除不加内标物溶液外,其余按“2.6” 项下方法操作所得残渣加入各组分对照品溶液和内标物溶液,并在35 ℃氮气流吹干后,再用乙腈-水（1 ∶1）溶液复溶,涡旋充分混合,离心后取上清液进样分析,每个浓度平行制备6份,记录色谱图。测量各组分和内标物的峰面积记为B。以前种处理方法所得的峰面积A与后种处理方法获得的峰面积B均值分别计算药物的和内标物的提取回收率。结果见表4。

2.8.4.2 基质效应 取各组分标准溶液和内标物溶液,置于EP管中,35 ℃下氮气流吹干后用乙腈-水（1 ∶1）溶液溶解残渣,涡旋混合,离心后取上清液进样分析,每个浓度3个样本,记录色谱图,测定各组分色谱峰面积和内标物峰面积为C。以“2.8.4.1” 项下所得峰面积B,与峰面积C均值的比值分别计算各组分和内标物的基质效应。结果见表4。结果表明各组分和内标物不存在明显的离子抑制或离子增强现象［13］。

2.8.5 稳定性试验 按“2.8.3” 项下方法制备各组分的低、中、高3个浓度的质量控制溶液,每一浓度平行3份。按“2.6” 项下方法,经过室温6 h,-80 ℃保存14 d,3个冻融循环后测定其浓度,实验结果表明,所测的各组分在大鼠肾组织样品中稳定性均在±15%范围之间,表明本实验的生物样品相对稳定。

3 结果

大鼠灌胃给予生黄柏和盐黄柏水煎液后,在不同时刻摘取大鼠肾组织脏器,采用UPLC-QqQ-MS法对肾组织中的生物碱类组分的浓度进行测定,结果见表5。

表4 各检测组分的提取回收率和基质效应（n=6）Tab.4 Extraction recovery and matrix effects and for the analytes in rats kidney tissue （n=6）

表5 大鼠给予生制黄柏后肾组织中各检测组分质量浓度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5 大鼠给予生制黄柏后肾组织中各检测组分质量浓度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5显示,大多数生物碱成分的含有量,在大鼠灌胃给药后,随着时间推移,其浓度逐渐降低,而少部分生物碱如巴马汀和小檗碱在灌胃给药约6 h后,其浓度又有小幅升高,推测黄柏生物碱成分在大鼠体内的吸收可能存在肝肠循环［14-17］。此外,同一检测组分,在同一给药时间后,盐黄柏相对于生黄柏在大鼠肾组织脏器中的生物碱含药浓度较高,表明盐炙后各组分有增强趋向肾组织作用效果。

4 讨论

黄柏作为盐炙品种的代表中药之一,其经过盐炙之后可以引药下行入肾,增强了滋肾阴、泻肾火、退虚热的作用。结果表明,黄柏中的生物碱类成分黄柏碱、木兰花碱、药根碱、巴马汀以及小檗碱类,在黄柏盐炙之后,同一给药时间后,其大多数都是盐炙品中的生物碱浓度高于生品中的生物碱,从而表明黄柏经过盐炙之后,生物碱类成分更加趋向于肾组织脏器的分布,进而治疗肾脏相关的疾病。前期实验,课题组复制了肾阴虚的大鼠模型,考察不同黄柏炮制品对于肾阴虚大鼠的治疗效果,并通过实验结果可以看出黄柏经过盐炙之后有更好的滋肾阴、泻肾火的作用［9］。本实验将前期的药效学进行机理上的验证,即为黄柏经过盐炙之后,可以增强其有效成分在肾组织的吸收。

本实验通过给予大鼠不同炮制品的黄柏水煎液,考察其中生物碱类成分在肾组织脏器的药物浓度情况,发现盐炙品浓度高于生品,从肾组织吸收率的角度验证了黄柏“盐炙入肾” 的理论。而黄柏如何经过盐炙后,使其生物碱类成分在肾组织吸收效率提高,还需要从黄柏有效成分与肾组织的靶标酶以及生物碱类成分与肾小管上皮细胞的透过率进一步深入研究。