凤尾草提取物通过调控lncRNA PGM5-AS1抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭

2020-12-13佳王梓瑜鸥王军韩江李兆连

中成药 2020年11期

金浩余佳王梓瑜乔鸥王军韩江李兆连*

（1.云南省第一人民医院普通外科，云南昆明 650032；2.昆明理工大学附属医院普通外科，云南昆明 650032；3.武汉大学人民医院肝胆外科，湖北武汉 430060）

肝癌是常见的恶性肿瘤,近年来研究发现中药可以通过抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、以及逆转肝癌细胞耐药性和增强机体免疫力等方面阻止肝癌的进展,为肝癌的治疗提供了新思路［1-2］。凤尾草是一种传统的药用植物,其有效活性成分包括黄酮类、萜类、苯丙素类、挥发油等化合物,具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤的作用［3］。研究报道凤尾草总黄酮可抑制人脑胶质瘤U251细胞的迁移能力［4］。凤尾草总黄酮可抑制宫颈癌U14细胞的生长,其是通过提高机体免疫功能发挥抗肿瘤的作用［5］。凤尾草提取物在体外对肝癌细胞株BLE-7402、小鼠黑色素瘤细胞株B16-BL6、人白血病细胞株HL-60细胞增殖均有抑制作用［6］。研究表明lncRNA参与肿瘤的转移发生过程,可作为新型肿瘤标志物［7］。磷酸葡萄糖变位酶5反义RNA1（phosphoglucomutase 5 antisense RNA1,PGM5-AS1）是一种新发现的lncRNA,研究发现PGM5-AS1在肺癌中下调表达,通过抑制细胞增殖发挥抑癌功能［8］。PGM5-AS1与黑色素瘤的发生和转移显著相关［9］。PGM5-AS1与亚洲人食管鳞癌患者生存相关,可能参与食管鳞癌的形成与进展［10］。然而凤尾草提取物和PGM5-AS1对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响还尚不清楚。本实验旨在研究凤尾草提取物和PGM5-AS1对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响以及凤尾草提取物是否通过调控PGM5-AS1起作用。

1 材料

1.1 细胞与试剂肝癌细胞株HCC9204 （货号8691,美国ATCC公司）；胎牛血清（货号10270-106）、DMEM培养基（货号11965-175）（上海高创化学科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（货号BB-3201,上海贝博生物科技公司）；BCA试剂盒（货号ZKP0746,深圳子科生物科技有限公司）；MTT试剂盒（货号8028,美国Sciencell公司）；Transwell小室（货号354480）、Matrigel （货号354234）（美国BD公司）；总RNA提取试剂盒（货号17200,艾美捷科技有限公司）；反转录试剂盒（货号6210 A,北京百奥创新科技有限公司）；荧光定量试剂盒（货号DRR420 A,北京智杰方远科技有限公司）。

1.2 药材凤尾草购自亳州市源升堂药业有限公司（批号201800329）,经云南中医药大学中药学院浦仕彪教授鉴定为正品。

2 方法

2.1 凤尾草提取物的制备将凤尾草干燥后粉碎,用10倍量70%的乙醇浸泡30 min,回流提取3次,每次1 h,合并3次滤液,去渣后浓缩成浸膏,再用乙酸乙酯反复超声提取,得到提取物的浓缩部分,过滤除菌后4 ℃备用,提取率约为21.6%。

2.2 细胞培养与分组肝癌细胞株HCC9204用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,取对数生长期细胞HCC9204,分别用0、20、40、80 μg/mL凤尾草提取物处理记为不同浓度凤尾草提取物处理组；将pcDNA、pcDNA-PGM5-AS1分别转染至细胞HCC9204中,分别记为pcDNA组、pcDNAPGM5-AS1组；将si-NC、si-PGM5-AS1分别转染至细胞HCC9204中再用20 μg/mL凤尾草提取物处理记为20 μg/mL凤尾草+si-NC组、20 μg/mL凤尾草+si-PGM5-AS1组。

2.3 Western blot检测 Cyclin D1、p21、Ecadherin、MMP2蛋白表达收集各组培养48 h的细胞,提取细胞总蛋白,用BCA试剂盒检测蛋白浓度,然后将蛋白样品变性后进行电泳,再转至PVDF上,封闭后加入一抗4 ℃孵育过夜,洗膜后加入二抗室温孵育2 h,然后再用ECL发光液显影,成像后检测蛋白条带灰度值,以GAPDH为内参计算蛋白相对表达。

2.4 MTT检测细胞存活率收集各组培养48 h的细胞,按照试剂盒说明操作,酶标仪检测490 nm各孔吸光度值（OD）。以实验组和空白组的OD值比值作为细胞存活率（%）。

2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭细胞用无血清培养基培养12 h,制成细胞悬液。细胞迁移实验：Transwell上室和下室分别加入200 μL细胞悬液和DMEM含血清的培养液,培养48 h后用多聚甲醛固定细胞,再用结晶紫染色细胞,显微镜观察并计算。细胞侵袭实验：将培养基稀释后的Matrigel平铺Transwell上室,干燥凝固后,同迁移实验操作。

2.6 RT-PCR检测PGM5-AS1表达收集各组培养48 h的细胞,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,按照试剂盒使用说明进行PCR,以GAPDH为内参,引物序列 PGM5-AS1正向 5′-GGGCGGCTGAAGAAAAGAAGAATG-3′,反向 5′-TCAACAGACGGCTTCAGTGGTTG-3′；GAPDH正向 5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3′,反向5′-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3′；GAPDH正向 5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3′,反向5′-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3′。反应结束后,相对表达量用2-△△Ct法计算。

2.7 统计学分析采用SPSS 20.00进行统计学分析。计量资料以（）表示,两组比较行t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度的凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖的影响与0 μg/mL凤尾草提取物相比,凤尾草提取物（20、40、80 μg/mL）处理的HCC9204细胞中Cyclin D1表达降低,p21表达升高,细胞存活率降低（P＜0.05）,见图1、表1。

图1 不同质量浓度凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖蛋白表达的影响Fig.1 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on proliferating protein expression of HCC9204 cells

表1 不同质量浓度凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖的影响（， n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （，n=9）

注：与凤尾草提取物0 μg/mL组比较,*P＜0.05。

3.2 不同浓度的凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭的影响与0 μg/mL凤尾草提取物比较,凤尾草提取物（20、40、80 μg/mL）处理的HCC9204细胞中E-cadherin表达升高,MMP-2表达降低,细胞迁移、侵袭数降低（P＜0.05）,见图2、表2。

图2 不同质量浓度的凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响Fig.2 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

3.3 凤尾草提取物对细胞HCC9204中PGM5-AS1表达的影响与0 μg/mL凤尾草提取物比较,凤尾草提取物（20、40、80 μg/mL）处理的HCC9204细胞中PGM5-AS1表达升高（P＜0.05）,见表3。

表2 不同质量浓度的凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭的影响（， n=9）Tab.2 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

注：与凤尾草提取物0 μg/mL组比较,*P＜0.05。

3.4 过表达PGM5-AS1对HCC920细胞4增殖、迁移、侵袭的影响与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-PGM5-AS1组HCC9204细胞中PGM5-AS1表达升高,Cyclin D1、MMP-2表达降低,p21、Ecadherin表达升高,细胞存活率和迁移、侵袭数量降低（P＜0.05）,见图3、表4。

3.5 抑制PGM5-AS1能逆转凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖的作用与20 μg/mL凤尾草+si-NC组比较,20 μg/mL凤尾草+si-PGM5-AS1组细胞HCC9204中PGM5-AS1表达降低,Cyclin D1表达升高,p21表达降低,细胞存活率升高（P＜0.05）,见图4、表5。

表3 凤尾草提取物对HCC9204细胞中PGM5-AS1表达的影响（， n=9）Tab.3 Effect of P.multifidaextract on expression of PGM5-AS1 in HCC9204 cells （， n=9）

注：与凤尾草提取物0 μg/mL组比较,*P＜0.05。

3.6 抑制PGM5-AS1能逆转凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭的作用与20 μg/mL凤尾草+si-NC组相比,20 μg/mL凤尾草+si-PGM5-AS1组HCC9204细胞中E-cadherin表达降低,MMP-2表达升高,细胞迁移、侵袭数量升高（P＜0.05）,见图5、表6。

图3 过表达PGM5-AS1对HCC9204细胞增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响Fig.3 Effects of PGM5-AS1 overexpression on proliferation，migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

表4 过表达PGM5-AS1对HCC9204细胞增殖、迁移、侵袭的影响（， n=9）Tab.4 Effects of PGM5-AS1 overexpression on proliferation，migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

注：与pcDNA3.1组比较,*P＜0.05。

图4 凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖蛋白表达的逆转作用Fig.4 Reversed effect of P.multifidaextract on proliferation protein expression of HCC9204 cells

表5 凤尾草提取物对HCC9204细胞增殖的逆转作用（， n=9）Tab.5 Reversed effect of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （， n=9）

注：与凤尾草20 μg/mL+si-NC组比较,*P＜0.05。

4 讨论

肿瘤的发生发展受多因素调节,研究发现中药联合用药治疗恶性肿瘤具有多靶点、疗效持久、毒副作用低等优势,已成为抗肿瘤药物重要的研究方向［11］。有研究报道凤尾草总黄酮可抑制骨肉瘤MG-63细胞的迁移能力［12］。凤尾蕨总黄酮能抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长［13］。凤尾草甲醇提取物对宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞NCI-H460和乳腺癌细胞MCF-7均具有抗癌活性［14］。从凤尾草根分离出的蝶呤化合物具有抗人结肠癌细胞HCT116增殖的活性［15］。本实验结果显示,不同浓度凤尾草提取物处理的肝癌细胞HCC9204中Cyclin D1、MMP-2表达水平显著降低,p21、E-cadherin表达水平显著升高,HCC9204细胞存活率显著降低,HCC9204细胞迁移和侵袭数量显著降低。说明凤尾草提取物可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

图5 凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭蛋白表达的逆转作用Fig.5 Reverse effects of P.multifidaextract on migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

PGM5-AS1是间变性胶质瘤患者中免疫相关的lncRNA［16］。研究发现PGM5-AS1在乳腺癌中低表达［17］。 PGM5-AS1在食道鳞状细胞癌组织,血浆和细胞系中也下调表达,其低表达与患者不良分化,晚期肿瘤结转移（tumor node metastasis,TNM）分期和淋巴结转移呈正相关；p53诱导PGM5-AS1可在体外抑制食道鳞状细胞癌细胞的增殖,迁移和侵袭［18］。本实验结果显示,过表达PGM5-AS1可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。表明PGM5-AS1在肝癌中同样起抑癌基因作用。且本实验还发现不同浓度凤尾草提取物处理的肝癌细胞HCC9204中PGM5-AS1表达水平显著升高,抑制PGM5-AS1逆转了凤尾草提取物对细胞HCC9204增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示,凤尾草提取物可能通过上调PGM5-AS1抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

表6 凤尾草提取物对HCC9204细胞迁移、侵袭的逆转作用（， n=9）Tab.6 Reversed effects of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）