姜 兵，吴若铭，张 聪，钟孝正，洪 毅，沈晓燕*

（1.复旦大学药学院药理系，上海 201203；2.上海医药集团股份有限公司中央研究院，上海 201203；3.上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，山东青岛 266510）

抑郁症是一种异质性疾病,导致这种疾病的确切神经机制尚未被发现。抑郁症是一个日益严重的全球性问题,并一直与冠心病（coronary heart disease,CHD）的风险增加有关［1-2］。抑郁症与增加CHD风险的确切机制是复杂的、多因素的,目前还不完全清楚。CHD患者的抑郁症发病率是普通人群的2～3倍,约为15%～30%,女性约为男性的2倍,急性心肌梗死 （myocardial infarction,MI）后的年轻女性尤其受影响［3-4］。抑郁症是冠心病的一个危险因素,其特征是从轻微的抑郁症状到临床诊断的严重抑郁症,抑郁症和冠心病发病率的流行病学研究显示较高水平的抑郁症状与较高的风险相关［2］。

养心氏片由13种中草药（黄芪、党参、丹参、葛根、淫羊藿、山楂、地黄、当归、黄连、醋延胡索、灵芝、人参、炙甘草）组成,功效为益气活血、化瘀止痛。适于气虚血瘀所致的胸痹,症见心悸气短、胸闷、心前区刺痛,广泛用于临床治疗冠心病。临床研究表明,养心氏片可以促进经皮冠状动脉介入治疗后的康复,并降低心血管事件的发生率［5］。根据临床观察,养心氏片能够改善冠心病合并抑郁状态［6］。多项Meta分析结果表明,养心氏片在治疗冠心病心绞痛、心律失常以及慢性心力衰竭上具有较高安全性［7］,并且能提高常规西药治疗的疗效［8］。本研究对养心氏片治疗心肌梗死后合并抑郁症大鼠的药效进行观察,并探讨相关机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 养心氏片（0.6 g/片,批号150505）购自上海医药集团青岛国风药业股份有限公司；盐酸氟西汀片购自常州四药制药有限公司；0.9%氯化钠注射液购自江西科伦药业有限公司；水合氯醛、羧甲基纤维素钠购自国药集团；TRIzol、RT Reagents、SYBR mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DEPC购自碧云天生物技术研究所；TNF-α 试剂盒、IL-1β 试剂盒、IL-6试剂盒购自上海达科为生物技术有限公司；5-HT试剂盒、CORT试剂盒、ACTH试剂盒、NE试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2 仪器 基因扩增仪购自美国BIO-RAD公司；超微量分光光度计购自中国上海宝予德有限公司；酶标仪购自瑞士Tecan Systems Inc公司；心电监护仪SMUP-PC购自中国上海嘉龙教仪厂；小动物呼吸机购自中国北京中西化玻仪器有限公司；小动物超声机Vevo 2100 lmaging System购自加拿大Visual Sonics公司。

1.3 动物 50只SD雄性大鼠（180～220 g）购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物生产许可证号SCXK （沪）2012-0002。大鼠饲养于复旦大学SPF级别动物房中,可以自由食用无菌食物和水。所有动物操作程序均符合中国动物福利法和复旦大学实验动物伦理委员会的有关规定。动物伦理批准号2018-10-YL-SXY-01。

2 方法

2.1 分组 50只大鼠随机分为假手术组、模型组（等体积0.5% CMC-Na）、氟西汀组（10 mg/kg）、养心氏片低剂量和高剂量组（500、1 000 mg/kg）,每组10只,灌胃给药4周,1次/d。将大鼠饲养于SPF级动物房中,正常提供食物和水,保证12 h光照周期。

2.2 造模及给药 使用10% 水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。将大鼠置于手术台上固定,连接心电图监护系统,并记录术前心电图,大鼠胸前左侧至腋窝处手术备皮,仰卧位固定于手术台上,75%酒精消毒手术视野。经气管切开插管,以专用小动物呼吸机行正压人工呼吸,打开胸腔暴露心脏,轻轻将心脏包膜分离用医用棉棒挑起左心耳,暴露左心耳与肺动脉圆锥之间的结扎区域。用6～0的医用缝合针线在离左心耳与肺动脉圆锥交接处2 mm左右永久性结扎左冠状动脉前降支。观察心电图变化,显示ST段抬高≥0.15 mV,并且心脏出现因缺血而致的颜色改变,结扎成功,用医用棉球和棉棒清除胸腔内积血。观察呼吸情况良好,对好肋间肌肉和肋骨,缝合胸腔,假手术组仅穿过左冠状动脉前降支而不结扎,其余操作与梗死组动物相同,手术后将大鼠单笼饲养。造模成功后进行强迫游泳诱发抑郁症［9］。大鼠心外膜颜色的改变证实了心脏缺血。完成手术造模的第2天,评估心梗以确认心肌梗死造模成功。通过行为学实验来评价大鼠抑郁程度,包括糖水消耗、游泳不动时间以及旷场运动评估抑郁症状造模成功。大鼠在胸部和皮肤闭合及拔管后返回笼中恢复7 d后,进行强迫游泳诱发抑郁症,游泳结束后的第2天进行行为学评价。大鼠在确认心梗模型造模成功后,开始给药,大鼠心肌梗死后抑郁模型的造模周期为10 d。在进行造模前,假手术组、模型组、氟西汀组、养心氏片低剂量和高剂量组,每组分别为12只大鼠,心梗造模过程中,假手术组、模型组分和氟西汀组别各死亡1只大鼠,养心氏高剂量组死亡2只大鼠；在抑郁造模过程中,模型组和养心氏低剂量组各死亡1只大鼠。最终每组选择10只大鼠进行后续的实验以及数据分析。

2.3 心脏彩超检测 造模成功后,每组中的10只大鼠进行超声心动图检测,利用小动物超声机记录左室收缩末期容积（LVESV）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室舒张期内径（LVIDd）、左室收缩期内径 （LVIDs）等,并计算左室射血分数（EF%）和左室短轴缩短率（FS%）。

2.4 蔗糖水偏好测试 实验前在安静的房间内,训练动物适应含糖饮水,每笼同时放置2个水瓶,第一个24 h内,2瓶均盛1% 蔗糖水,随后的24 h,一个瓶盛1%蔗糖水,另一个瓶盛纯水。禁食禁水24 h后,每只大鼠给予事先定量好的2瓶水：一瓶1%蔗糖水,一瓶纯水,1 h后,取2瓶水称量。计算大鼠的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗。糖水偏爱=（糖水消耗/总液体消耗）×100%。

2.5 强迫游泳实验 将大鼠单个放入水深为25 cm的塑料圆筒中 （高45 cm,直径30 cm）,水温25 ℃,时间共6 min,前2 min作为大鼠适应阶段,后4 min纳入不动状态的时间统计。

2.6 旷场实验 根据大鼠穿越底面方格块数作为水平活动得分,以直立次数作为垂直活动得分,水平和垂直活动得分总和为总评分。敞箱装置为长宽各100 cm （底面被等分为25个等边方格）、高50 cm各面漆黑的箱子。将大鼠放入中心格内,观察大鼠在3 min内穿越格数（四爪均进入的方格才记数,为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁,为垂直运动得分）。

2.7 血清中生物标志物的测定 按照相应的ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中TNF-α （肿瘤坏死因子-α）、IL-1β （白细胞介素-1β）、IL-6 （白细胞介素-6）、5-HT （5-羟色胺）、CORT （血清皮质酮）、ACTH （释放促肾上腺皮质激素）、NE（去甲肾上腺素）水平。

2.8 RT-PCR检测 称取海马适量置于1.5 mL离心管中,加入TRIzol 1 mL室温静置5 min后,加入200 μL氯仿,剧烈震荡15 s后静置2 min,4 ℃、12 000 g离心15 min,吸取上清置于新的1.5 mL离心管中,加入异丙醇500 μL,室温放置10 min,4 ℃、12 000 g离心10 min,加入1 mL 75%乙醇,4 ℃、7 500 g离心5 min,弃上清,晾干后加入20 μL DEPC水溶解。将提取的RNA逆转录为cDNA,加入正反向引物进行扩增。引物由上海生工工程有限公司合成,序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

3 结果

3.1 养心氏片改善心肌梗死后抑郁大鼠的心脏功能 表2、图1显示,与假手术组比较,模型组中的大鼠心功能严重受损,主要表现为LVIDd、LVIDs和LVEDV、LVESV增大（P＜0.01）,FS和EF减小（P＜0.01）；与模型组比较,养心氏片能够改善心脏功能（P＜0.05,P＜0.01）。

3.2 养心氏片缓解心肌梗死后大鼠的抑郁症 表3～5显示,与假手术组比较,模型组中的大鼠不论是对于糖水的偏好（P＜0.01）,强迫游泳中运动时间（P＜0.01）,旷场实验中运动得分（P＜0.05）都下降。与模型组比较,氟西汀组大鼠的以上指标均有改善（P＜0.05,P＜0.01）,显示建模成功。与模型组比较,养心氏片组中大鼠的糖水偏好（P＜0.05）,旷场实验中运动得分（P＜0.05）上升；强迫游泳中的不动时间下降（P＜0.01）,显示养心氏片能够有效缓解大鼠心肌梗死后的抑郁症状。

表2 超声心动图的血流动力学参数比较（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

表2 超声心动图的血流动力学参数比较（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

注：与假手术组比较,**P＜0.01；与模型组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

图1 各组大鼠心脏彩超图Fig.1 Cardiac color Doppler ultrasonography of rats in each group

表3 各组大鼠糖水消耗比较（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

表3 各组大鼠糖水消耗比较（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

注：与假手术组比较,**P＜0.01；与模型组比较,#P＜0.05。

表4 各组大鼠游泳不动时间比较（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

表4 各组大鼠游泳不动时间比较（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

注：与假手术组比较,**P＜0.01；与模型组比较,##P＜0.01。

表5 各组大鼠旷场实验运动得分比较（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

表5 各组大鼠旷场实验运动得分比较（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

注：与假手术组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与模型组比较,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.3 养心氏片降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎症水平 图2显示,与假手术组比较,模型组大鼠血清中的炎症因子TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.01）、IL-6 （P＜0.05）水平上升。与模型组比较,养心氏片高剂量组大鼠血清的TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.05）、IL-6 （P＜0.05）下降,表明养心氏片能够有效降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎症水平。

3.4 养心氏片上调心肌梗死后抑郁大鼠的单胺神

经递质水平 图3显示,与假手术组比较,模型组中大鼠血清中5-HT （P＜0.01）、ACTH （P＜0.01）、CORT （P＜0.01）、NE （P＜0.01）下降,与模型组比较,氟西汀组（P＜0.05）与养心氏片高剂量组（P＜0.05,P＜0.01）大鼠的上述血清标志物升高。

3.5 养心氏片降低模型大鼠海马区的炎症水平及

图2 养心氏片对大鼠血清炎症因子水平的影响Fig.2 Effects of Yangxinshi Tablets on serum inflammatory factors levels in rats

图3 养心氏片对大鼠血清单胺神经递质水平的影响Fig.3 Effects of Yangxinshi Tablets on serum monoamine neurotransmitters levels in rats

抑制犬尿酸通路限速酶的表达 图4～5显示,与假手术组比较,模型组中大鼠TNF-α（P＜0.01）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表达上升。与模型组比较,养心氏片高剂量组大鼠TNF-α（P＜0.05）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表达下降。对于犬尿酸通路中限速酶,养心氏片对IDO1、 KMO、 KYNUmRNA表达与TNF-α、IL-6呈现出相同的趋势（P＜0.05）。表明养心氏片能够有效降低心肌梗死后抑郁大鼠海马区的炎症水平并抑制犬尿酸通路中限速酶的表达。

4 讨论

在冠心病患者中,抑郁与功能损害的严重程度、治疗的依从性和心脏康复的参与度降低有关。多项荟萃分析为临床抑郁症（状）与冠心病之间的关联提供了证据［10-11］。尽管研究结果存在一些异质性,但大部分证据支持这样一种观点,即急性冠脉综合征（acute coronary syndromes,ACS）后抑郁是全因和心脏死亡率的危险因素,以及包括死亡率或非致命性心脏事件在内的复合终点［3］。中国的一项前瞻性队列研究,对633例非阻塞性冠状动脉（MINOCA）患者进行3年随访,显示抑郁与全因死亡率和心血管事件的显著相关性［12］。在冠心病患者中,抑郁症状是生活质量（QoL）的最强预测因子［13］。抑郁症不仅独立于CHD的严重程度与日常生活心绞痛相关,而且相较于冠状动脉疾病或其他传统风险指标更能预测心绞痛的严重程度［14］。本研究的实验结果显示,养心氏片能够有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心脏功能,同时明显缓解抑郁症状。

图4 养心氏片对大鼠海马区炎症因子的影响Fig.4 Effects of Yangxinshi Tablets on inflammatory factor in hippocampus of rats

图5 养心氏片对大鼠海马区犬尿酸通路限速酶表达的影响Fig.5 Effects of Yangxinshi Tablets on the expression of rate-limiting enzyme in kynurenine pathway in rat hippocampus

抑郁症和较差的冠心病预后之间的潜在机制是复杂的,多因素的。抗抑郁药作用于大脑中的5-羟色胺,多巴胺和去甲肾上腺素系统以及其他神经递质回路,包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂,三环抗抑郁药,5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂以及其他作用机制的抗抑郁药。但是,这些药物同样引起心血管不良反应,如QT间期的延长、低血压、心律失常和出血风险增加等［15］。

一个与抑郁症相关的冠心病风险增加的假设机制是慢性炎症,这是动脉粥样硬化和冠心病发展的已知风险因素［16］。作为心血管疾病（cardiovascular diseases,CVD）结果的预测因子,IDO1的过度表达伴随着色氨酸（tryptophan,TRP）分解代谢的增加被证明可由慢性系统性低度炎症（chronic systemic low-grade inflammation,CSLGI）引起［17］。作为控制Trp分解代谢速率的限速酶,IDO1可被干扰素和白细胞介素等促炎细胞因子激活［18］。抑郁症与持续的炎症状态和增加的炎症因子浓度有关,如TNF-α、IL-1β 和IL-6,对心脏和循环有已知的不良影响［19］。在临床上,炎症被认为是抑郁患者的潜在病因和治疗目标［19］。本实验证实养心氏片能够有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁症状,同时显著降低大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和海马区的炎症（TNF-α、IL-6）水平。

由于犬尿氨酸（kynurenin,KYN）途径的代谢分流导致可用于血清素（5-HT）合成的TRP的减少被认为是抑郁症可能的病理生理机制［20］。研究证实抑郁症中存在促炎状态,IDO1参与KYN介导的代谢分流,加速TRP的消耗并且促进TRP代谢为KYN［21］。一项广泛的队列研究显示IDO1活性与动脉粥样硬化初始阶段和颈动脉中膜厚度增加呈正相关［22］。人体内的KYN及其代谢产物3-羟基犬尿氨酸 （3-hydroxykynurenine,3HK）、喹啉酸（quinolinic acid,QUIN）和犬尿喹啉酸（kynurenic acid,KYNA）的水平与抑郁症密切相关［23］。这些化合物具有导致抑郁的作用,包括调节神经细胞死亡,谷氨酸转移和神经炎症［24］。在促炎条件下,KYN与神经炎症有关,并被认为有助于抑郁症的发病机制［24］。与健康对照受试者比较,抑郁症患者的血浆KYNA和KYNA/KYN比率显著降低,且接受6周选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）治疗可显著增加首发抑郁症的初治患者的KYNA/KYN比率［25］。临床实验结果显示,SSRI抗抑郁药艾司西酞普（escitalopram）可通过抑制具有神经毒性的犬尿氨酸代谢物的合成而发挥其抗抑郁作用,并且通过减少炎症反应来发挥其抗抑郁作用［26］。本实验发现,养心氏片能够有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁症状,并且显著上调单胺神经递质水平。同时,养心氏片能够有效降低大鼠海马区中炎症水平和抑制犬尿酸途径中限速酶（IDO1、KMO和KYNU）的表达。

以上证据表明,炎症增强以及相关的KYN代谢失衡可能是CVD和抑郁症共有的病理生理机制。因此,抗炎治疗、抑制KYN的代谢途径同时增加单胺神经递质的利用,为冠心病合并抑郁症患者治疗提供了可能的策略。目前的抗抑郁西药均能够透过血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）,直接作用于脑部。但是中药成分复杂,多数活性成分溶解性较差。本实验结果表明,养心氏片可以通过减轻炎症反应、抑制犬尿氨酸途径、增加单胺神经递质,同时改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能以及抑郁症状,以期为养心氏片治疗心血管疾病合并抑郁症的临床应用提供实验依据,也为中药“脑病外治”“心脑同治” 提供参考。