彭晓鹏，黄劲松，周成斌，吴 敏

［1.广东省心血管病研究所广东省华南结构性心脏病重点实验室广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；2.东莞康华医院心血管中心心外科，广东东莞 523000）

提要：华法林是目前世界上使用最广泛的抗凝血药物。其抗凝血活性基于对正常血液凝固所必需的多种维生素K 依赖性（vitamin K-dependent，VKD）凝血因子合成的抑制作用。华法林还可影响与止血无关的VKD 蛋白的合成，其中包括某些促进骨骼生长和血管钙化的蛋白。华法林抗肿瘤的作用部分源于其抗血栓的能力，另一部分则源于其对非止血性VKD 蛋白以及与VKD 蛋白无关的其他蛋白质功能的影响。华法林的炎症和免疫调节作用表明了该药物在疾病的生理和病理过程中具有更广泛的前景。本文根据已发表的数据概述了华法林除抗凝血之外的生物学作用。

华法林上市60 多年来，因其具有抗凝和溶栓双重调节作用、疗效显著、服用方便、价格低廉等特点而广泛应用于多种疾病的治疗和预防，尽管新型抗凝药物研发取得了重要的进展，并已经或即将上市，但是华法林作为最早的口服抗凝药物之一仍是需要长期抗凝治疗患者的最常用药物之一。但在此药的既往使用中，人们发现其不仅仅拥有抗凝血的能力，更有抗肿瘤、免疫调节等其他鲜为人知的药理作用。本文通过华法林的抗凝血作用及最新对华法林病理、生理作用的研究进展，向读者介绍华法林促进骨骼生长和血管钙化、抗肿瘤、炎症/免疫调节作用，表明华法林在多种疾病的生理和病理过程中具有更广泛的应用前景。

1 华法林的抗凝血作用

华法林是香豆素类抗凝剂的一种，在肝脏微粒体内通过抑制维生素K 环氧化物还原酶的活性从而阻断还原型维生素K（维生素KH2）的生成，进而抑制维生素K 依赖性（vitamin K-dependent，VKD）凝血因子的γ-羧基化作用。VKD 凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的氨基末端谷氨酸可在维生素K 的促使下羧基化转变成γ-羧基谷氨酸，从而促进VKD 凝血因子结合到磷脂表面，加速血液凝固。因此，华法林仅能在体内有活性的凝血因子消耗后才能有效，起效后作用和维持时间亦较长。

华法林已使用60 余年，至今仍是世界上最广泛使用的抗凝药物［1］。据估计，美国有3 000 多万处方使用华法林［2］，英国超过1%的人口使用华法林［1］。由于华法林具有抗凝作用并能在肠道中有效（完全和快速）吸收，它被证明是预防和治疗静脉血栓、肺动脉和全身栓塞最广泛使用的药物［3］。华法林治疗窗窄、剂量变异性大、易与其他药物及食物相互作用、需要实验室监测等特点促使研究人员寻找副作用范围更窄、治疗范围更广的替代药物［4］。由于大多数瓣膜手术患者术后不需要长期口服抗凝治疗，对伴随心房颤动的患者使用新型抗凝药来管理是十分合理的选择。但对于因风湿性二尖瓣狭窄而进行生物二尖瓣置换并伴有心房颤动的患者是一个例外。虽然患者二尖瓣血流在二尖瓣置换术后正常化，但其心房仍很大且严重病变。因此，这些患者中维生素K 依赖性VKD 可能是优于新型抗凝药的选择，但这需要更多临床数据证实［41］。

2 华法林和非止血维生素K 依赖性蛋白的关系

除了阻断VKD 蛋白在肝脏中的羧基化外，华法林还影响外周血的羧基化。以这种方式，这种维生素K 拮抗剂对调节骨生长和钙化的过程所需的VKD 蛋白［胃泌素释放肽重组蛋白（recombinant gastrin releasing peptide，GRP）、骨钙素（bone glaprotein，BGP）、骨钙素重组蛋白（recombinant osteocalcin，OC）、基质Gla 蛋白（matrix Gla protein，MGP）］的外周（肝外）生产的催化速率产生影响［5］；Hara 等［6］研究数据显示抑制华法林的醛羧化作用对肝脏的代谢过程没有影响，提示外周和肝脏VKD 蛋白的敏感性与前VKD 蛋白的敏感性不同。

大剂量华法林（7.7 mg·100 g-1·d-1）的摄入可导致骨矿化减少［7］。60～80 岁原发性高血压（高血压）患者长期（至少12 个月）使用华法林对骨代谢指标影响的测量显示，低羧化骨钙素（ucOC）及核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）受体激活物水平显著升高［8］，提示这些患者的钙化和骨质疏松增加。虽然也有研究表明，这种香豆素衍生物的使用和骨骼的不良发育之间没有关系，但长时间服用华法林对成年人和儿童骨骼的均有负面影响（某些骨骼部位的骨密度的损失）［9］。妊娠期服用华法林而出现相关的发育缺陷（“华法林胚胎病”）、骨骼异常被认为是由于华法林对在软骨内骨化前存在的功能性MGP 的生成的影响［10］。华法林所致的胚胎病也归因于其对骨钙素的作用［11］。

MGP 是血管钙化的主要抑制剂之一，当羧化成cMGP时，它通过与钙晶体直接结合抑制晶体生长的方式抑制抗矿物质活性，因此，华法林抑制MGP 羧化的途径被认为是动脉钙化的基础机制之一。长期（5～12 周）暴露于高剂量华法林（100 mg/kg）的大鼠在多个组织中发现动脉钙化，而给予高剂量维生素K 则减轻血管钙化［12］。大剂量华法林（15 mg/100 g）对大鼠血管钙化的影响是呈年龄/生长依赖性［13］。对已建立的动脉粥样硬化的ApoE-/-小鼠模型施用华法林还表明，华法林治疗可加速血管钙化以及斑块不稳定［14］。维生素K 环氧化物还原酶复合体1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）基因多态性不仅对华法林治疗反应的变异性有贡献，而且对血管疾病风险的差异也有贡献；使用华法林治疗要注意血管钙化的风险与出血风险并存的问题［15］。

除了通过抑制MGP 介导的血管钙化外，目前Beazley等［16］研究还提示谷氨酰胺转氨酶2（transglutaminase，TG2）/catenin 通路的激活是华法林诱导血管钙化的新机制。体外培养的主动脉平滑肌细胞标明TG2/-连环素轴参与华法林所致的钙化。TG2 活性是华法林诱导-连环素信号转导、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨样细胞转分化以及钙矿物沉积所必需的。低浓度的华法林（10 mol/L）与该药的治疗血浆浓度相对应，对VSMCs 中羧基（Gla）MGP 表达没有影响，而高剂量华法林（100 mol/L）则抑制了GlaMGP 的形成。因此推测华法林激活VSMC 中的连环蛋白是通过增强的血管骨形态发生蛋白信号（此通常被羧化MGP 蛋白抑制）实现的。

3 华法林的抗肿瘤活性

Edwards 等［17］研究表明香豆素并没有遗传毒性。包括华法林在内的抗凝药物是通过多方面影响肿瘤细胞生理功能而实现其抗肿瘤能力的。O′Rorke 等［18］研究表明，华法林与肺、乳腺、结直肠和前列腺肿瘤患者的病死率之间缺乏关联的薄弱环节。华法林的使用（诊断前或诊断后使用）、治疗持续时间、癌症类型和阶段的不同可能是造成上述研究数据差异的原因。华法林和联合化疗使得无法手术的胰腺癌患者中位生存时间延长［19］。这种作用在高危疾病患者中最明显，且无明显的转移证据，提示华法林可能具有抗肿瘤转移作用。华法林诱导的活性氧被认为是细胞毒性的主要原因，但某些肿瘤的转移能力的降低不能归因于华法林的细胞毒性作用。体外实验证明［20］，大剂量华法林（5×10-4mol/L 和1×10-3mol/L）可抑制生长，促进红白血病K562 细胞和HL-60 细胞的辐射毒性；小剂量华法林（0.5～1 mg/L）也能抑制AXL 依赖性肿瘤细胞迁移和侵袭，增加肿瘤细胞凋亡和对化疗的敏感性。

最近的研究显示蛋白S 参与口腔鳞癌细胞（oral squamous cell，OSCC）的体外存活、增殖和迁移、小鼠肿瘤生长以及肿瘤细胞表达AXL［21］。由于华法林抑制蛋白S 的羧化，推测华法林的抗肿瘤作用可能与抑制该止血蛋白的非止血活性有关。在华法林治疗肺癌细胞系的体外和动物模型中，来自肺癌患者的自然杀伤细胞活性的增加表明华法林具有免疫刺激作用。Paolino 等［22-23］最近研究揭示了自然杀伤细胞介导的华法林抗肿瘤作用的可能分子机制：对荷黑色素瘤小鼠给予华法林后，自然杀伤细胞的活性增强，肺部和远端器官的肿瘤转移减少。华法林抗肿瘤转移的基础是消除自然杀伤细胞的活性的抑制（通常由TAM 受体和E3 泛素连接酶Cbl-b 介导）。华法林通过TAM/Cbl-b 途径促进了自然杀伤细胞细胞的释放，并增强了它们对原型靶细胞的细胞毒性。因为这两种作用均是在低浓度的华法林（不产生抗凝作用）被注意到的，所以作者认为这与华法林的抗凝机制无关。大量体外和体内实验数据表明，其他抗凝药物，特别是低分子量肝素（low-molecular-weight heparins，LMWHs）同样具有减少肿瘤负担和转移潜能的能力，在改善癌症患者生存方面可能更安全有效［24］。Peltier 等［25］最近研究表明，华法林的糖基化降低了抗VKOR 活性，同时增加了体外对几种癌细胞系的细胞毒性。

4 华法林在炎症和免疫调节中的作用

Saminathan 等［26］研究显示大剂量华法林治疗的患者中IL-6 的浓度增加。在华法林相关性肾病（Warfarinrelated nephropathy，WRN）的急性肾损伤研究中也同样发现这一现象［27］。血红素毒性和血红素诱导的氧化应激被认为是急性肾损伤的主要机制，这其中就包括抗凝剂相关的急性肾损伤［28］。血红蛋白和血红素在肾小管细胞中积累可导致活性氧的产生、细胞损伤、促炎性因子和促纤维化细胞因子释放。使用大鼠肾单位减少（5/6 肾切除术）和华法林过度抗凝模型作为华法林相关肾病模型的研究发现［29］，可通过使用抗氧剂N-乙酰半胱氨酸（antioxidant in N-acetylcysteine，NAC）实现对急性肾损伤的预防［30］。氧化应激还被认为在华法林诱导的高血压中起作用［31］，因为用华法林联合NAC 治疗的大鼠收缩压增加较慢，尽管这种作用仅在华法林诱导的高血压的早期（一周）可见。然而，通过补充维生素K 预防华法林诱导的大鼠收缩压升高意味着血管内皮细胞（骨钙素、MGP 或GAS6）上有表达的VKD 蛋白的参与。抗凝相关肾病的另一个机制是止血蛋白凝血酶和蛋白C 的减少［32］。华法林诱导的凝血酶耗竭致使内皮屏障遭到破坏，导致肾小球出血。因此蛋白C 的减少和通过内皮蛋白C 受体的信号传导，也是抗凝剂诱导的急性肾损伤的另一机制。

华法林治疗所产生的并发症与嗜酸性粒细胞炎［33］、嗜酸性胸膜炎［34］和过敏性间质肾炎、真细胞碎屑性血管炎、伴有血管改变和中性粒细胞白细胞和单核细胞浸润［35］等有关，表明华法林具有诱发过敏性炎症反应的潜能。在动物实验和体外实验中也观察到华法林的免疫刺激和免疫抑制作用。使大鼠口服30 d 与人类治疗期间的平均剂量相同的华法林剂量，大鼠表现出肠道炎症，其特点是白细胞浸润、组织损伤和促炎细胞因子干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）的浓度增加［36］。从肠匀浆中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的下降和丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度的升高来判断，氧化应激可能是肠道组织损伤的原因。口服华法林对两种大鼠菌株的肠道免疫反应性具有不同的影响，表明了华法林的免疫调节作用中基于遗传的差异的重要性［37］。大鼠口服华法林30 d后，观察到皮肤炎性反应细胞因子（TNF、IL-1 和IL-6）和表皮细胞对接触性过敏原的反应［38］，表明口服华法林具有调节皮肤天然免疫的潜力。这些数据证实了华法林的局部应用具有免疫调节潜力，其表现为肥大细胞的激活、刺激表皮细胞增殖和皮肤组织炎性细胞因子增多（TNF 和IL-1）［39］。给大鼠口服与人治疗期间剂量相当的华法林30 d 后，观察到期间全身炎症反应增加（血浆IL-6浓度以及主要大鼠急性期蛋白、触珠蛋白浓度增加）［40］，这可能是由于华法林局部（肠、肝和皮肤）促炎作用伴随有全身水平的炎症改变。

5 结论

尽管存在明显的副作用，但华法林仍是目前使用最广泛的口服抗凝剂之一［41］。通过抑制与凝血无关的VKD 蛋白的生成，这种维生素K 拮抗剂还影响除止血以外的生理过程，这表明该药物在组织和细胞生物学方面仍有较大的作用潜力。不参与止血的VKD 蛋白在生理和病理过程中的作用尚待进一步研究，预期还可能发现新的功能。因此，应时刻保持对华法林病理生理的密切关注。