何旭华 阚欢 黄陆繄 张娟 刘灿 刘云

摘 要：本研究采用超声波辅助乙醇提取云南核桃分心木黄酮，通过正交试验优化了提取工艺条件。选取AB-8大孔树脂对黄酮提取液进行纯化，并研究了纯化后黄酮提取液的抗氧化活性。结果表明，在乙醇浓度50%、料液比1∶50 g·mL-1和超声时间12 min时，黄酮得率为7.15%，纯度为48.35%。抗氧化活性试验中，黄酮浓度为2.5 mg·mL-1时，DPPH和ABTS自由基清除率分别达到90.68%和60.24%，铁离子还原力吸光值为0.456，即云南核桃分心木黄酮有较强的抗氧化性活性。

关键词：云南核桃;分心木;黄酮;提取工艺;纯化;抗氧化性

Abstract：The flavonoids of distracted wood from Juglans sigilata was extraction by ultrasound， and the extraction process was optimized by orthogonal experiment. AB-8 macroporous resin was selected to purification the flavonoids， and the antioxidant activity of the flavonoids was determined. The results show that the ethanol concentration 50%， the ratio of material to liquid 1∶50 g·mL-1， and ultrasonic time 12 min， the yield of flavonoids was 7.15% and the purity was 48.35%. In the antioxidant activity test， when the concentration of flavonoids was 2.5 mg·mL-1， the free radical scavenging rates of DPPH and ABTS reach 90.68% and 60.24%， respectively， and the absorption value of iron ion reducing power was 0.456， so the flavonoids of distracted wood have strong antioxidant activity.

Key words：Juglans sigilata; Distracted wood; Flavonoids; Extraction process; Purification; Antioxidant

中圖分类号：R284

云南核桃（Juglans sigilata）分心木，是胡桃科（Jualandaceae）核桃属（Juglans）植物核桃果仁之间的干燥木质隔膜，又称胡桃隔、胡桃夹、胡桃衣等，占核桃质量的4%～5%。核桃分心木体轻质脆且易折断，颜色呈棕色或浅棕褐色[1-2]，味道苦涩、食性平和。新疆少数民族医学记载，分心木可改善体寒、肾虚的生理虚弱，且治疗多梦、遗精、遗尿、尿血、泄痢、牙龈出血、带下和口腔溃疡等多种疾病[3-4]。研究表明，核桃分心木富含多种生物活性成分，包括黄酮、有机酸、酚类、生物碱、油脂、皂苷、挥发油、氨基酸、鞣质、糖类、多肽及其他微量化合物，其中黄酮类化合物含量较高[5-9]。

黄酮类物质广泛存在植物中，是以α-苯基苯并吡喃酮为主体的一系列物质，被广泛应用在食品添加剂和治疗疾病方面，它能抑制人体产生有害的自由基，也能清除多余的自由基，可延缓衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病和癌症[10]。相关研究表明，核桃分心木的水提液或醇提液能抗菌，所含黄酮皂苷物质具有较强的抗氧化效果，可改善小鼠的肾阳虚病症[11-13]。云南省作为全国最大的核桃生产基地，也是深纹核桃的原产地和高产区，其核桃具有种源独特、品质好、产量高、产值高、营养丰富、味道醇香等优点，深受大众欢迎[14-15]。分心木作为核桃副产物，开发利用不足，其有一定的药用价值和食用价值，富含多种营养成分。研究其抗氧化性能，以治疗疾病和开发天然的抗氧剂。

本文研究云南核桃分心木中黄酮的提取及工艺优化，并初步纯化黄酮提取液，考察纯化液对DPPH、ABTS自由基清除，以及铁离子还原力的抗氧化活性。为深入研究和开发利用核桃分心木提供参考依据，同时提高云南核桃副产物经济收益和资源利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃分心木，云南磨浆农业有限公司提供。AB-8大孔树脂，购自安徽三星树脂科技有限公司;芦丁标准品，购自上海源叶科技有限公司;1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），购自合肥博美生物科技有限责任公司;亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、无水乙醇（99.7%）、过硫酸钾、铁氰化钾、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、六水合三氯化铁，购自天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

UV-2600紫外可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司生产;YB-250A型高速多功能粉碎机，永康市速峰工贸有限公司生产;SHZ-DⅢ循环水式多用真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司生产：SB25-12DTDS超声波清洗机，宁波新艺超声设备有限公司生产;KH20R-Ⅱ台式冷冻高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司生产;2.5 L型冷冻干燥机，LABCONCO公司生产;RV3V旋转蒸发仪，艾卡仪器设备有限公司生产;DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司生产;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥机，上海齐欣科学仪器有限公司生产。

2 方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[16]，方法稍做改动。精密称量10 mg芦丁标准品，溶解于30%乙醇并定容至100 mL。以0.1 mg·mL-1芦丁标准品作为母液，按浓度梯度分別配制浓度为0.000、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070 mg·mL-1和0.080 mg·mL-1的标准溶液于10 mL容量瓶中，分别加入0.3 mL 5%（质量分数）NaNO2和10%Al（NO3）3，再加入4 mL 4%NaOH，每次加液间隔6 min，最后用30%乙醇定容至10 mL。均匀混合静置15 min，510 nm处测定样品吸光值，每组平行测定3次。

以芦丁标准品吸光值（Y）对芦丁浓度（X）进行回归分析，回归方程为Y=5.356 6X+0.086 6，R2=0.999 44，具有良好的线性关系，芦丁标准曲线具有较强的可靠性。所得芦丁标准曲线如图1所示。

2.2 总黄酮提取及测定

核桃分心木预处理：将云南核桃分心木分拣，清洗，铺于不锈钢托盘置50 ℃恒温干燥箱，干脆后经粉碎机粉碎，过80目筛保存于密封袋。

称1 g核桃分心木，用一定浓度乙醇溶解并置超声波中辅助提取，抽滤得黄酮粗提液，定容至50 mL，备用。参照标准曲线测定方案，取0.6 mL备用液于10 mL容量瓶测定分心木黄酮吸光值，将吸光值代入标准曲线方程算出黄酮浓度，利用得率方程（1）算出黄酮含量。

式（1）中，C-黄酮浓度，g·mL-1;V-黄酮提取液总体积，mL;M-分心木质量，g。

2.3 单因素试验

选取乙醇浓度、料液比、超声时间进行单因素试验，分析3个因素对黄酮得率的影响。试验设计见表1。

2.4 正交试验设计

以单因素试验结果为基础，设计三因素三水平正交试验，优化单因素对核桃分心木黄酮提取的影响，确定最优方案。试验设计如表2。

2.5 核桃分心木黄酮分离纯化试验

最优工艺下，称20 g分心木超声提取，抽滤，旋蒸浓缩，用型号为AB-8的大孔树脂以样液每3 s一滴进行洗脱纯化，按2.2方法测定纯化液黄酮含量，冷冻干燥得黄酮干重，按公式（2）计算黄酮纯度。

式（2）中，m-黄酮粗提物质量，g;M-纯化后分心木黄酮干重，g。

2.6 核桃分心木黄酮抗氧化性研究

2.6.1 DPPH自由基清除率的测定

用棕色容量瓶配制一定浓度的DPPH-乙醇溶液，参考Cheng等的方法[17]，适当调整。分别取样品、DPPH-乙醇溶液2 mL于10 mL离心管，避光，37 ℃水浴30 min。在517 nm处测吸光值A1，无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液测吸光值A2，无水乙醇代替样品液测吸光值A0，平行测3次，取平均值。按公式（3）计算DPPH自由基的清除率（RSA表示自由基清除活性）。

式（3）中，A0-空白吸光值，A1-样品吸光值，A2-无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液吸光值。

2.6.2 ABTS自由基清除率的测定

参照文献[18]改进方案，将7 mmol·L-1 ABTS自由基与140 mmol·L-1过硫酸钾溶液于棕色容量瓶中等体积混合，静置反应12 h，即得ABTS自由基反应液。在734 nm处用无水乙醇稀释ABTS自由基反应液吸光值至0.700±0.02，避光现用。取2 mL样品溶液，2 mL ABTS自由基反应液于10 mL离心管，混合摇匀10 s，静置6 min后，于734 nm处测吸光值A1，样品用无水乙醇代替测吸光值A0，平行测定3次，取平均值。按公式（4）计算ABTS自由基的清除率：

2.6.3 铁离子还原力的测定

参照高行恩等[19-20]的方法适当调整，取2.0 mL样液于10 mL离心管，加入5 mL 0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH=6.6）和5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴反应30 min，降至室温后，加入5 mL 10%三氯乙酸，4 000 r·min-1离心10 min。分别取5 mL离心管上清液、蒸馏水和0.1%三氯化铁，均匀混合静置10 min，700 nm处测吸光值。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 乙醇浓度对云南核桃分心木黄酮得率的影响

乙醇浓度对云南核桃分心木黄酮得率的影响如图2所示。由图2可知，黄酮得率随乙醇浓度的增大呈先增大后急剧减小趋势，当浓度为40%时达到最大值3.38%。黄酮类化合物因结构不同而呈现不同的极性，依据相似相溶原理，极性越大提取物的杂质越多，黄酮得率越小;极性越小黄酮溶出量越少，得率越小。因此，选取40%乙醇时，黄酮得率最大。

3.1.2 料液比对云南核桃分心木黄酮得率的影响

料液比对云南核桃分心木黄酮得率的影响如图3所示。由图3可知，核桃分心木黄酮得率随料液比增加呈现上升趋势，当料液比为1∶70 g·mL-1时，核桃分心木黄酮的得率最大，其最大得率为2.80%。溶剂对分心木中的黄酮具有扩散作用，且溶剂体积越大，对核桃分心木中黄酮的扩散作用越大，而分心木中黄酮的扩散能力越强，黄酮得率越大。料液比为1∶60 g·mL-1和1∶70 g·mL-1时，黄酮得率相差较小，黄酮浓度接近饱和，考虑到成本及资源合理利用，最终选择黄酮提取的最佳料液比为1∶60 g·mL-1。

3.1.3 超声时间对云南核桃分心木黄酮得率的影响

超声时间对云南核桃分心木黄酮得率的影响如图4所示。由图4可知，核桃分心木黄酮得率随时间呈先增加后减少的趋势：当超声时间为6～12 min时，得率呈上升趋势;12～14 min时，呈下降趋势;超声时间为12 min时，有最大得率2.93%。核桃分心木中黄酮随超声时间延长向提取溶剂扩散并达到溶解平衡，因此提取量不断增加至最大值;超声时间越长，黄酮结构越易被破坏和氧化，导致提取量下降。此外，超声时间延长，会造成能源过度消耗，综合考虑超声时间应选择12 min。

3.2 正交试验

单因素基础上，以黄酮得率为指标，采用L9（34）正交试验设计表进行试验，试验结果见表3。

由表3可知，影响核桃分心木黄酮得率的主次顺序为B>C>A，最优工艺为A3B1C2，即乙醇濃度为50%、料液比1∶50 g·mL-1、时间12 min。

采用方差分析以减小试验误差，提高试验精准度，同时分析分心木黄酮提取受各因素影响的程度，见表4。利用显著性检验，查表得临界值F0.01（2，2）=99.00，F0.05（2，2）=19.00，所以对于给定的显著性水平，由表4可知，FA=26.05>F0.05（2，2），FB=99.19>F0.01（2，2），FC=65.28>F0.05（2，2），通过正交试验方差分析表可得，因素A、C对试验有显著影响，因素B对试验有非常显著的影响。

3.3 黄酮粗提物纯化

选取最优工艺，核桃分心木中黄酮经过纯化试验后，黄酮纯度为48.35%。

3.4 分心木抗氧化活性分析

以3.3纯化液为样品，DPPH、ABTS自由基清除率和铁离子还原能力为指标，进行黄酮抗氧化性研究，结果见表5。

由表5可知，分心木黄酮纯化液对DPPH、ABTS自由基和铁离子均有一定清除效果，在试验浓度范围内，黄酮浓度与自由基清除率呈正相关，随浓度增大而增大。不同黄酮浓度对DPPH和ABTS自由基清除效果不同，浓度在0.5 mg·mL-1，DPPH清除率比ABTS高35.688个百分点，铁离子还原能力吸光值为0.173。浓度在2.5 mg·mL-1时，DPPH自由基清除率高达90.681%，对DPPH自由基清除效果较强，对ABTS自由基清除率良好，清除率为60.236%。黄酮浓度在0.5～2.5 mg·mL-1时，吸光值从0.173增长到0.456，分心木黄酮的还原能力较强，抗氧化性较好。

4 结论

本文运用正交试验设计，优化云南核桃分心木黄酮提取，试验表明，乙醇浓度50%、料液比1：50 g·mL-1、超声时间12 min是云南核桃分心木黄酮的最优提取方案，得率为7.15%。粗提物经过AB-8大孔树脂纯化，纯度为48.35%。纯化液对DPPH、ABTS自由基和铁离子的抗氧化试验表明：云南核桃分心木黄酮有较高的抗氧化性，可制备天然的抗氧化剂，为开发核桃分心木黄酮药物奠定基础。

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