刘锐，坚彩明，孙兴，王莹，杜娟，米志宽，赵菊梅

0 引言

2018年有209万新发肺癌病例和176万人死于肺癌[1]。在我国，全性别癌症死亡第一位的就是肺癌[2]。目前对于肺癌的治疗有多种方法，安全性和患者生存质量均有所提升，但总体生存率仍处于较低水平。有研究表明，3098例Ⅳ期NSCLC患者手术切除治疗后的5年生存率是21.1%[3]。免疫治疗可将晚期NSCLC患者5年生存率提升数倍[4]，所以认为免疫治疗可为患者带来更多获益。提高患者机体抗肿瘤免疫水平，改善治疗效果，是目前较为关注的一种治疗方法。β防御素-2（beta defensin-2,MBD2）可诱导树突状细胞，使其从幼稚转化为成熟[5]，增强机体的抗肿瘤免疫功能。水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）基质蛋白（matrix protein,MP）在病毒引起的细胞凋亡中起着主导作用[6]，研究表明，VSVM诱导细胞发生凋亡的机制是抑制宿主基因的表达[7]，且其在线粒体凋亡途径中也发挥着作用[8]。本实验通过构建MBD2和VSVM的共表达质粒，转染至肺癌LL/2细胞中，探讨MBD2联合VSVM对肺癌细胞增殖的影响及其体外DC细胞趋化活性，为肺癌免疫治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒 肺癌LL/2细胞购自中国科学院上海细胞库，延安大学医学院医学肿瘤防治重点实验室保存。质粒pVITRO2-VSVM、pVITRO2-MBD2及pVITRO2-VSVM-MBD2由本实验室构建并保存。

1.1.2 主要试剂、试剂盒 Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；胰蛋白酶、DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；Triton X-100、牛血清白蛋白和羊抗兔IgG购自美国Sigma公司；β防御素-2（兔来源）、GAPDH（兔来源）购自英国Abcam公司；青霉素和链霉素购自北京悦康凯悦制药有限公司；质粒小提试剂盒购自中国天根生化科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒和AnnexinV-PE/7-ADD双染细胞凋亡检测试剂盒购自中国碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 CKX41倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；-80℃低温冰箱购自日本Panasonic公司；蛋白电泳设备、恒压、恒流电泳仪和冷冻离心机购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养细胞 复苏肺癌LL/2细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、5%CO2及湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养。定时倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长状态良好，对数生长期时进行传代培养，进行后续实验。

1.2.2 质粒转染 收集生长状态良好的LL/2细胞，接种于96孔或6孔培养板，待对数生长期时采用脂质体（Lipofectamine2000）转染细胞。参照说明书制备质粒脂质体复合物，吹打混匀，孵育20 min。待LL/2细胞密度为70%～80%时，弃去完全培养基，PBS漂洗2次，加入上述转染复合物37℃培养箱中孵育4～6 h后换用新鲜完全培养基，分别转入pVSVM、pMBD2、pVSVM+pMBD2、pVSVM-MBD2，另设脂质体转染组和空白对照组。绿色荧光蛋白质粒（pVITRO2-GFP）作为参照，观察绿色荧光的表达情况以判断质粒转染效率，继续培养24～48 h进行后续实验。

1.2.3 RT-PCR检测目的基因MBD2及VSVM的表达 实验所用VSVM、MBD2cDNA 序列信息由NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=）搜索获得，VSVM和MBD2的RT-PCR引物用Primer Premier 5.0软件设计，经UCSC Genome Browser模拟检测及RTPCR预检测正确后使用。引物序列为VSVM-F:5'-CGATTGAGCTCACAATGACC-3'；VSVM-R:5'-ATCAGGCCAAACATTAAGGC-3'；MBD2-F:5'-CACCAATGGAGGGTACTGTG-3'；MBD2-R:5’-GGGTTCTTCTCTGGGAAACA-3’。RT-PCR按照TaKaRa公司的RT-PCR检测试剂说明书提取LL/2细胞总RNA。RT-PCR进行定量分析，据检测结果，以β-actin为内参基因（β-actin-F:5'-CCCAGGCATTGCTGACAGG-3'；β-actin-R:5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'），采用2-ΔΔCt=[（Ct目的基因-Ct质控）sample A-（Ct目的基因-Ct质控）sample B)]分析各基因的相对表达量变化。

1.2.4 Western blot检测转染细胞中MBD2蛋白水平的表达 收集转染后培养48 h的LL/2细胞，PBS洗涤，RIPA裂解液裂解细胞，BCA分析测定蛋白质浓度。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个蛋白质样品20～40 µg，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉稀释一抗，将膜放入4℃冰箱孵育过夜，同样方法稀释二抗室温孵育2 h，在暗室中进行ECL检测，观察条带情况。

1.2.5 MTT法检测各质粒转染组对肺癌LL/2细胞生长的抑制作用 倒置显微镜观察LL/2细胞，将对数生长期细胞用PBS洗涤，加入1 ml的胰酶消化液至细胞变圆，加入2 ml的DMEM培养基至瓶底细胞全部脱落终止，制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为1×105个/毫升，按每孔200 μl接种于96孔细胞培养板，放入培养箱待细胞生长至70%～90%时，按照上述脂质体转染法转染细胞，每组设置6个复孔，转染细胞后放置在37℃、5%CO2的培养箱中继续培养36、48、60和72 h时，取出培养板，每孔加入10 μl配置的5 mg/ml MTT溶液，放置在37℃、5%CO2的培养箱中继续培养，4 h后取出培养板，吸取上清液，加入DMSO 150 μl振荡混匀，使用酶标仪检测490 nm吸光度值，重复三次取平均值，计算不同质粒转染后，LL/2细胞的生长抑制率。

1.2.6 各质粒转染组对肺癌细胞LL/2凋亡的细胞形态学观察 当LL/2细胞生长状态良好、处于对数期时处理细胞，制成单细胞悬液，浓度为1×105个/毫升，每孔2 ml接种于六孔板，采用上述方法培养并转染细胞，分别于转染后36、48、72 h取出培养板，PBS洗涤，PI染液至覆盖盖玻片，荧光显微镜下观察各组细胞形态的变化，每个时间点分别重复三次。

1.2.7 各质粒转染组对细胞凋亡率的影响 细胞培养与转染方法同1.2.6，转染细胞培养48 h取出，严格按照说明书操作制成浓度为1×106个/毫升单细胞悬液，吸取100 μl的重悬液到流式管中，加入5 μl Annexin V-PE混匀后避光孵育5 min，加入10 µl 20 µg/ml的7-AAD（核酸染料），并加入400 µl PBS，立即行流式细胞术检测，实验重复3次。

1.2.8 MBD2趋化活性检测 各组质粒转染细胞后，继续培养48 h收集上清液，调整DC浓度为5×106个/毫升。加入DC细胞悬液于transwell小室上层，质粒转染细胞，收集上清液置于下层，孵育16 h。吸弃上层液体，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜计数，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件分析数据。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒转染LL/2细胞效率

结果显示，转染后24 h开始表达绿色荧光蛋白，48 h达到较高表达，荧光显微镜下计数发现绿色荧光蛋白的表达量可达80%，提示我们转染方法及质粒载体具有较高的转染效率，细胞转染效率达 80%以上，见图1。

2.2 RT-PCR检测各质粒转染组目的基因表达

图1 pGFP转染LL/2细胞48h后GFP表达量Figure 1 GFP expression in LL/2 cells after pGFP transfection for 48h

与空白对照组相比，pVSVM、pVSVM+pMBD2质粒共转染及pVSVM-MBD2转染组中，均可检测到VSVM基因的表达；pMBD2、pVSVM+pMBD2及pVSVM-MBD2转染组，均可检测到MBD2基因的表达，表明各重组质粒在LL/2细胞中均能表达目的基因，见图2。

图2 LL/2细胞中目的基因mRNA相对表达量Figure 2 Relative expression of target gene mRNA in LL/2 cells

2.3 Western blot检测细胞重组质粒转染后LL/2细胞MBD2蛋白水平的表达

在空白对照组、pVITRO2-GFP转染细胞及pVSVM转染组均未检测到MBD2表达；而转染pMBD2及pVSVM-MBD2质粒组总蛋白中检测到MBD2的表达，表明重组质粒可在肺癌LL/2细胞中表达目的蛋白，见图3。

2.4 MTT实验分析重组质粒对LL/2细胞生长的抑制作用

pVSVM、pVSVM+pMBD2共转染和pVSVMMBD2双表达质粒转染的LL/2细胞，有明显生长抑制作用，且pVSVM-MBD2转染组细胞抑制更明显，与单纯脂质体转染组相比差异有统计学意义（F36=475.6,P36＜0.001；F48=541.0,P48＜0.001;F60=1191.0,P60＜0.001;F72=613.4,P72＜0.001），而pMBD2转染组细胞抑制作用不明显，见图4。

图3 Western blot检测MBD2在各处理组LL/2细胞中的表达Figure 3 MBD2 expression in LL/2 cells of each treatment group detected by Western blot

2.5 PI荧光染色法观察细胞形态变化

空白对照组、脂质体转染组的LL/2细胞生长良好、胞质丰富、细胞核明显、细胞密度较高，生长速度快于其他转染组；而pVSVM、pVSVM+pMBD2共转染及pVSVM-MBD2转染组细胞形态变化明显，细胞密度较小，出现体积变小、变圆、核固缩等凋亡的形态学表现，与之相比，空白对照组、脂质体转染组和pMBD2转染组的细胞形态变化不明显，见图5。

2.6 Annexin V-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡率

空白对照组凋亡率为（4.82±0.21）%，脂质体转染组凋亡率为（7.85±1.35）%，pMBD2转染组凋亡率为（21.6±2.03）%，pVSVM转染组凋亡率为（30.81±2.26）%；pMBD2+pVSVM转染组凋亡率为（31.80±3.02）%；pVSVM-MBD2转染组凋亡率为（56.30±4.31）%。各组间细胞凋亡率差异有统计学意义（F=164.3,P＜0.001），进一步进行各转染组与空白对照组比较，细胞凋亡率差异有统计学意义（t脂质体=3.841,P脂质体=0.0184;tpMBD2=14.24,tpVSVM=19.83,tpMBD2+pVSVM=15.44,tpMBD2-pVSVM=20.66,均P＜0.05），见图6。

图4 重组质粒对LL/2细胞增殖的影响Figure 4 Effect of recombinant plasmids on proliferation of LL/2 cells

2.7 MBD2趋化活性检测

各组质粒转染细胞后趋化活性差异有统计学意义（F=212.7,P＜0.001）。进一步比较Lip2000与pMBD2、pVSVM-MBD2质粒间的趋化能力，差异有统计学意义（tpMBD2=18.07,tpVSVM-MBD2=17.24,P＜0.001）；比较pVSVM与pMBD2、pVSVMMBD2质粒之间的趋化能力，差异有统计学意义（tpMBD2=17.97,t pVSVM-MBD2=17.13,P＜0.001）；比较pMBD2和pVSVM-MBD2质粒之间的趋化能力，差异有统计学意义（t=3.413,P=0.027,P＜0.05），见图7。

图5 LL/2细胞转染后PI染色检测细胞核形态Figure 5 Nuclear morphology of LL/2 cells after transfection detected by PI staining

图6 流式细胞仪检测细胞凋亡Figure 6 Cell apoptosis detected by flow cytometry

图7 质粒转染LL/2细胞后对DC的趋化作用Figure 7 Chemotaxis of DC after plasmid transfection of LL/2 cells

3 讨论

目前肿瘤的免疫治疗备受关注，正在成为研究热点。在恶性肿瘤的治疗中，肿瘤免疫治疗已经取得了重大突破[9-11]。机制为通过激发机体免疫功能，提高机体的抗肿瘤作用，达到杀伤肿瘤细胞的目的。本研究中，MBD2是天然免疫分子，参与机体的天然免疫应答。先前已被证明小鼠MBD2诱导骨髓源性iDC成熟的机制是作为内源性配体与Toll样受体4直接作用，β-防御素能与MIP-3a（小鼠巨噬细胞炎性反应蛋白）竞争，抑制它与抗体CCR6转染细胞的结合，趋化诱导幼稚DC细胞和记忆T细胞，促使免疫应答的发生，提示MBD2可能在机体的免疫监视中发挥作用，可将其用于肿瘤免疫治疗。细胞凋亡是一种自主有序的死亡，这一过程的紊乱往往会诱发许多疾病。有研究表明，抑制肿瘤细胞的增殖活性，促进肿瘤细胞的凋亡是肿瘤治疗的关键[12]，提示我们可以通过调控肿瘤细胞的增殖与凋亡来进行抗癌治疗。本研究中，VSV是一种溶瘤病毒（OV），其基质蛋白是主要的致毒因素，VSVM可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡[13]。

本研究结果显示，pVSVM、pVSVM+pMBD2双质粒与pVSVM-MBD2融合质粒转染组细胞形态变化明显，镜下观察到细胞体积变小、变圆及核固缩等凋亡的形态学表现。与转染pVSVM+MBD2质粒和pVSVM相比，转染pVSVM-pMBD2双质粒对肺癌细胞的抑制作用明显增强。本研究结果表明，VSVM和MBD2的联合作用诱导了肿瘤细胞的凋亡，对肿瘤细胞的生长产生抑制作用，且双表达质粒转染组比单独转染组的效果更显著。可能的原因是，防御素与水泡口炎病毒基质蛋白可同时在细胞中表达，增强其诱导肿瘤细胞的凋亡的作用，研究表明防御素具有诱导细胞凋亡的作用[14]，两者联合增强了其作用效果。也可能是溶瘤病毒激活免疫信号，促进免疫组分与肿瘤细胞之间相互作用，进而导致肿瘤细胞死亡[15]，具体机制尚待进一步研究。另外，DC趋化实验结果显示，VSVM与MBD2共表达质粒仍保留了MBD2趋化活性，即pMBD2具有良好的DC趋化作用。已有研究表明，β-防御素具有强大的趋化活性[16]。即MBD2可以招募未成熟的DC细胞和记忆T细胞CCR6，机制是与TLR4相互作用。也就是说，MBD2可以将未成熟的DC细胞招募至肿瘤所在位置，从而发挥其抗原呈递功能，增强免疫反应。对VSVM而言，因为OV可以促进部分细胞毒性T淋巴细胞反应增强，且效果与抗原激动性肿瘤疫苗相似，使其成为了免疫检查点阻断的联合治疗的理想伴侣[17]，所以在我们的研究中选择MBD2和VSVM的联合作用对肿瘤细胞的影响，可能是MBD2诱导了幼稚DC和T细胞成熟，提高机体获得性免疫能力，同时VSVM也可激活细胞毒性T淋巴细胞，两者联合加强了抗肿瘤的免疫反应。

综上所述，MBD2和VSVM联合作用，使细胞形态发生明显改变，可以抑制肺癌细胞LL/2的增殖，诱导其凋亡，并保留了防御素的趋化功能，有望成为肺癌治疗的新策略。本研究探讨MBD2和VSVM共表达质粒对肺癌细胞的作用效果，但具体机制尚未明确，还需以此细胞实验为基础进一步深入研究。