高洪彬，梁 十，郭扬清，吴玉娥，贾欢欢，刘 婵，王希龙，陈梅丽

免疫荧光检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点[1]，为病理检测中一项重要的辅助技术。HE染色是常规的病理学检测方法，有时HE染色下病变的确诊或进一步研究需要进行免疫荧光染色辅助，此时往往会选择重切蜡块，但重切的切片与HE观察不是同一张组织片、需要观察的位置或多或少的发生了改变，不利于与原HE切片进行精准的比较分析，更甚者有些组织块小、重切片未能切出组织切片进行免疫荧光染色。因此，探讨一种HE切片褪色后进行免疫荧光染色的方法具有重要的应用价值。本实验通过实践，摸索了一些简便有效的HE切片染色褪色后进行免疫荧光染色的方法并进行比较分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境(普通级)食物蟹猴3只，由广东春盛生物公司提供[SCXK(粤)2014-0027]，所有涉及实验动物的实验方案经动物关怀与使用伦理委员会批准。动物饲养场所按照国际实验动物评估和认证管理委员会的规定和要求，对动物进行日常的饲养关怀和管理。

1.2 仪器与试剂采用的仪器包括Leica TP1020自动脱水机，Leica EG1150H+C石蜡包埋机，Leica RM2255全自动轮转切片机、Leica ST5020+SV5030全自动染色封片一体机，Leica DM3000正置荧光显微镜。

采用的试剂有1%盐酸乙醇分化液(褪色剂)、胰岛素抗原(Gene Tex公司)、PBS缓冲液(博士德生物公司)、胰蛋白酶(南京建成生物工程研究所)、免疫染色封闭液(碧云天生物公司)、荧光二抗(Invitrogen Life Technologies公司)、二甲苯(天津市百世化工公司)、无水乙醇(广州中南化学有限公司)、95%乙醇(广州凯秀贸易有限公司)、1%醇溶性伊红(广州凯秀贸易有限公司)、Harris苏木精(广州凯秀贸易有限公司)、TO透明剂(广州市中南化工仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1分组 选取3只血糖正常的食蟹猴胰腺常规脱水包埋后的蜡块标本，连续切片后用多聚赖氨酸防脱玻片捞片，分为4组，每组3张，即：空白切片高压修复免疫荧光组(A组)，空白切片胰蛋白酶修复免疫荧光组(B组)，HE切片褪色后高压修复免疫荧光组(C组)，HE切片褪色后胰蛋白酶修复免疫荧光组(D组)。

1.3.2HE染色 使用未进行染色的空白切片烤片，然后在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分别浸泡20 min进行脱蜡，梯度乙醇脱水至纯水，每个步骤7 min。Harris苏木精染色10 min，苏木精染色结束后再置于自来水中浸洗1 min，然后进行1%盐酸乙醇分化5 s，再转移到自来水中返蓝15 min。 待返蓝结束后转移到90%乙醇浸泡7 min，然后进行1%醇溶性伊红染色30 s，在伊红染色后转移到95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ以及95%乙醇Ⅲ中分别浸泡10 s，然后分别转移到无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中脱水各5 min，最后在TO透明剂Ⅰ、TO透明剂Ⅱ中分别浸泡7 min，封片。

1.3.3免疫荧光染色 A组：使用未进行染色的空白切片烤片，脱蜡，梯度乙醇水化后PBS冲洗3次、每次5 min，高压修复(高压锅喷气后5 min停止加热，待自然冷却至室温)，PBS冲洗3次、每次5 min，荧光封闭液封闭1 h，一抗孵育(4 ℃冰箱过夜)，复温(37 ℃ 60 min)，PBS冲洗3次、每次5 min，二抗孵育(37 ℃ 60 min)，PBS冲洗3次、每次5 min，晾干，封固。B组：与A组比较，抗原使用1.25%胰蛋白酶修复(37 ℃ 30 min)，不使用高压修复，其余与A组方法步骤相同。C组：使用进行过HE染色的切片二甲苯浸泡，去除盖玻片和中性树胶，梯度乙醇水化褪色，放入用75%乙醇配制的1%盐酸乙醇分化液中浸泡1 min，待晾干后，再放入1%的盐酸乙醇分化液中1 min，反复数次直至颜色完全褪去，然后用自来水缓慢冲洗。接着使用PBS冲洗3次、每次5 min，进行高压修复等与A组相同的步骤和方法进行免疫荧光染色。D组：与C组比较，抗原使用1.25%胰蛋白酶修复(37 ℃ 30 min)，不使用高压修复，其余步骤与C组方法相同。

1.3.4病理组织学观察 使用显微镜进行组织学观察。C、D组在HE褪色前进行镜下观察和拍照，不同组不同动物的免疫荧光染色切片使用同一荧光强度和倍数观察、拍照。

2 结果

HE染色镜下观察，见胰岛大小不一、散在分布，胰岛细胞呈团索状分布，胞质淡染。各组胰岛中均可见INS阳性荧光表达的胰岛β细胞。A、C组切片可见部分组织破碎、脱落，B、D组切片未见破碎、脱落。各组各区域综合比较，阳性细胞明亮、清晰，各组间抗原表达强度、染色效果未见明显差异(图1～4)。

图1 HE切片褪色后高压修复免疫荧光组：可见胰岛中β细胞呈强阳性，细胞明亮、清晰 图2 HE切片褪色后胰蛋白酶修复免疫荧光组：可见胰岛中β细胞呈强阳性，细胞明亮、清晰 图3 空白切片高压修复免疫荧光组：可见胰岛中β细胞呈强阳性，细胞明亮、清晰 图4 空白切片胰蛋白酶修复免疫荧光组：可见胰岛中β细胞呈强阳性，细胞明亮、清晰

3 讨论

HE染色是组织病理学检查的常规检查方法[2]，石蜡切片在行HE常规染色步骤包括有机溶剂脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、伊红染色、梯度乙醇脱水、有机溶剂透明、封固等[3]，操作过程在常温下进行，整个HE染色过程未接触破坏抗原的溶剂及实验条件，抗原得到较好的保存。常用的树脂等封片剂由于溶于有机溶剂二甲苯[4]，经二甲苯充分的浸泡可除去盖玻片并去除组织上附着的封片剂。1%盐酸乙醇分化液的浸泡可对苏木精染色的组织细胞进行褪色[5]，有研究报道HE切片经过数次浸泡可进行褪色[6]，提示其对伊红也有褪色作用，本实验使用1%盐酸乙醇分化液对HE染色的切片有较好的褪色效果，镜下未见组织细胞的苏木精或伊红着色。

本实验观察到完成褪色的标本，按常规方法和程序进行免疫荧光染色即可得到较理想效果。同一抗原修复方法下的比较显示，HE褪色后进行染色的切片与空白片直接染色的切片比较，抗原表达强度相当，提示HE染色及褪色后INS抗原保存得较好。有研究表明酶消化能较好的修复抗原[7-8]，本实验显示，对于INS抗原，使用高压和胰蛋白酶修复均取得较佳染色效果，但胰蛋白酶消化的切片组织块不易发生破碎、脱落，较好的保留了待观察组织的完整性。