薛晓伟　李星奇　王德田*

经溶剂回收仪再生的二甲苯在快速冷冻病理中的染色效果研究

薛晓伟①李星奇①王德田①*

目的：对使用CBG BIOTECH溶剂回收仪再生的二甲苯与新开封二甲苯在手术快速冷冻病理中的染色效果进行比较。方法：选取40例测试病理组织，OCT包埋后制作冷冻切片2张，分别使用再生和新开封二甲苯进行染色处理，就其染色后的组织结构、细胞核及细胞质的染色情况进行评分。结果：在快速冷冻病理中再生二甲苯与新开封的二甲苯在组织结构细胞核染色以及细胞质染色评分相比，差异无统计学意义(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)。结论：再生的二甲苯可以应用于快速冷冻病理的HE染色法染色。

二甲苯；回收；HE染色法；快速冷冻病理；CBG BIOTECH溶剂回收仪

[First-author’s address] Department of Pathology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China.二甲苯为无色透明液体，具有一定的毒性，但因其价格低廉，透明效果好，是病理科常用的试剂之一[1-2]。由于脱水透明的过程中不可避免地存在液体携带与损耗，为保证染色质量，需要根据切片的负荷量等因素定期更换二甲苯，由此在废液处理过程中会对环境造成二次污染[3]。因此，实现二甲苯重复回收使用，不仅可有效地节约购买试剂的成本更重要的是保护环境，避免试剂的二次污染。然而，经回收后重复利用的二甲苯其应用效果是否能满足病理诊断的需要仍需加以考证[4-5]。尤其是再生二甲苯在术中快速冷冻病理中的应用效果尚未进行评价，故本研究对再生二甲苯与新开封二甲苯在术中快速冷冻病理中的染色效果进行比较。

1　材料与方法

1.1标本采集

收集2015年6-10月北京协和医院冷冻病理术后未经固定的40例患者手术标本，包括乳腺、肺、甲状腺、肾脏、胆囊以及子宫标本。标本类型涉及乳腺纤维腺瘤、乳腺腺病、肺腺癌、甲状腺腺瘤、肾透明细胞癌和肾囊肿、胆囊息肉及子宫肌瘤等，测试组织的来源及数量如表1所示。

表1　测试组织的来源及数量

将40例病理测试组织经OCT包埋后，冷冻切片机切成6～8 μm的切片2张，固定后分别使用再生二甲苯组和新开封二甲苯组进行染色。所有测试标本均为术中快速病理诊断完成后不影响冰余常规诊断的剩余组织，制作成1 cm×1 cm×0.3 cm的组织块，避免脂肪及坏死组织。

1.2仪器及试剂

采用CM3050 S冷冻切片机(德国，徕卡)；CBG BIDTECH立式溶剂回收仪(美国)；Aperio数字病理扫描仪与分析系统(德国，徕卡)；AX10共览显微镜(德国，蔡司)。试剂采用冷冻包埋剂OCT(德国，徕卡)；冷冻固定液、苏木素染液、伊红染液、分化液以及返蓝液(北京九州柏林生物有限公司)；无水乙醇，新开封二甲苯(国药集团)。

1.3回收二甲苯

开启回收仪的电源并抽吸10 L废二甲苯至处理桶内→选择程序“处理二甲苯(XYLENEMODE)”→进行再生→回收后的二甲苯会流入接收瓶内，废液入废液桶。

1.4二甲苯纯度测定

使用CBG BIOTECH医用酒精二甲苯立式回收仪的测试程序对所回收的二甲苯进行纯度测试。在100 ml的量筒中加入85 ml的再生二甲苯，后加入去离子水补齐至100 ml，盖好量筒的盖子倒转混合物，至分离点液面平稳后读数a。已再生二甲苯的纯度计算为公式1：

1.5染色流程及评分

(1)切片经冷冻固定液固定—自来水冲洗—苏木素染色—自来水洗—分化—返蓝—伊红染色—自来水洗—梯度酒精脱水——分别使用再生二甲苯和新开封二甲苯进行透明—中性树胶封片。

(2)采用随机数字表分法在病理诊断医师库里抽取2名医师就组织结构染色、细胞质的染色及细胞核的染色等3方面对切片的染色质量进行单盲评分，得分范围为0～3分：①0分，染色无法满足诊断的需要；②1分，染色基本能满足诊断的需要，但是效果较差；③2分，染色能够满足诊断的需要，效果一般；④3分，染色能够满足诊断的需要，效果较好[6]。

1.6统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件对数据结果进行统计，计数资料以均数±标准差(x-±s)表示，对评分进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1再生二甲苯纯度

根据二甲苯与水不相溶的特点，在测试量筒读取二甲苯与水的分离点，运用纯度公式(1)计算出再生二甲苯的纯度稳定在99.2%～99.5%之间，表明再生的二甲苯纯度基本与新开封二甲苯的纯度相似。

2.2染色效果

使用再生二甲苯和新开封二甲苯对测试组织冷冻切片进行透明染色，肉眼观测染色效果，再生二甲苯使用HE染色法染色同样可以获得与新开封二甲苯一样的效果，即切片组织完整，厚薄均匀，核浆分明，符合优良片的标准[7-8]，如图1所示。

图1　新开封和再生二甲苯透明的冷冻切片HE染色图(×100)

2.3染色评分

随机抽取的病理医师就2种处理的切片打分结果显示，快速冷冻病理中再生二甲苯与新开封的二甲苯在组织结构、细胞核染色以及细胞质染色评分上相比均无明显统计学差异(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)，见表2。

表2　HE染色的评分情况比较

表2　HE染色的评分情况比较

组织结构得分细胞核得分细胞质得分新开封二甲苯2.36±0.292.48±0.282.50±0.29再生二甲苯2.37±0.312.49±0.312.44±0.31 t值1.381.451.32 P值0.780.820.20

3　讨论

目前，术中快速病理诊断主要应用冷冻切片，其质量的好坏直接影响着手术方案的确定。因此，冷冻切片的HE染色法染色比常规石蜡切片具有更为苛刻的要求。

二甲苯作为冷冻切片染色过程中的透明试剂，切片在进入二甲苯前，其水分已经完全被无水乙醇所替代，若二甲苯中含水，极易被组织吸收，封片时出现中性树胶与水不相容的现象，导致组织“发雾”，影响切片质量[9-11]。为保证冷冻切片的质量，常常需要对二甲苯进行更换，除此之外，病理科在常规组织处理过程中也会产生大量的废弃二甲苯液体，以往处理该废液时，采取直接倒入废液专道，或者交于环保部门集中处理，但是大多数情况下，这些有机溶剂会被焚烧或填埋，这样废溶剂不但得不到利用，还可能进入土壤以及大气，造成环境二次污染。如何有效的处理这些废弃液体，目前尚无国家或产业的统一规定，多数地区采取将病理科实验室产生的废弃液体按种类交由有资质的废液回收公司进行回收利用，这一做法虽然有效，但无形中增加了废液循环过程中的经济成本[12]。因此，回收仪的出现可实现废液的就地回收利用，有效地节约了处置废液的成本，实现资源的可持续利用。

病理科产生的废弃二甲苯中的主要杂质是乙醇和石蜡，根据二甲苯沸点(137～140 ℃)与乙醇沸点(78.4 ℃)不同，设定加热温度，进行加热，使低沸点组分蒸发，再冷凝以分离废液组分，即可回收到清洁二甲苯溶剂。

本研究在冷冻切片的HE染色过程中使用再生二甲苯，进行染色测试实验，切片染色评分也与传统二甲苯评分无显著的统计学差异[13-14]；再生二甲苯可以重新应用于术中快速冰冻病理的HE染色。同时，二甲苯的回收效率能够达到90%以上，依次计算每年可以节约大量的二甲苯购置成本。

[1]van Maldegem F，de Wit M，Morsink F，et al. Effects of processing delay， formalin fixation，and immunohistochemistry on RNA Recovery From Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Sections[J].Diagn Mol Pathol，2008，17(1)：51-58.

[2]Titford ME，Horenstein MG.Histomorphologic assessment of formalin substitute fixatives for diagnostic surgical pathology[J].Arch pathol lab med，2005，129(4)：502-506.

[3]Buesa RJ.Histology safety：now and then[J]. Ann Diagn Pathol 2007，11：334-339.

[4]Falkeholm L，Grant CA，Magnusson A，et al. Xylene-free method for histological reparation：A multicentre evaluation[J].Lab Invest 2001，81：1213-1221.

[5]Hipolito RN.Xylene poisoning in laboratory workers：vase reports and discussion[J].Lab Med，1980，11：593-595.

[6]薛晓伟，王德田，李星奇.Infinity HE高清恒染系统在病理常规染色中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2014，29(9)：1072-1073.

[7]Moelans CB，ter Hoeve N，van Ginkel JW，et al. Formaldehyde substitute fixatives. Analysis of macroscopy，morphologic analysis，and immunohistochemical analysis[J].Am J Clin Pathol，2011，136(4)：548-556.

[8]Ananthaneni A，Namala S，Guduru VS，et al. Efficacy of 1.5% dish washing solution and 95% lemon water in substituting perilous xylene as a deparaffinizing agent for routine h and e staining procedure：a short study[J]. Scientifica，2014(7)：307-310.

[9]Tian F，Wu Z，Yan Y，et al.Synthesis of Visible-Light-Responsive Cu and N-Codoped AC/TiO Photocatalyst Through Microwave Irradiation[J].Nanoscale Res Lett，2016，11(1)：292.

[10]王德田，董建强，梁智勇.实用现代病理学技术[M].北京：北京协和医科大学出版社，2012：61-62.

[11]丁伟，王德田，董建强，等.简明病理学技术[M].杭州：浙江科学技术出版社，2014：13-14.

[12]董建强，田玉旺.病理技术学科的规范化与质量控制[J].诊断病理学杂志，2013，20(12)：737-739.

[13]Metgud R，Astekar MS，Soni A，et al. Conventional xylene and xylene-free methods for routine histopathological preparation of tissue sections[J].Biotech Histochem，2013，88(5)：235-241.

[14]Buesa RJ，Peshkov MV.Histology without xylene[J].Ann Diagn pathol，2009，13(4)：246-256.

The assessment of histomorphologic stain effect of recyled xylene for surgical frozen pathology

XUE Xiao-wei, LI Xing-qi, WANG De-tian// China Medical Equipment, 2016,13(11):136-138.

Objective: To investigate the quality of tissue morphology of fast frozen sections between the recycled xylene and the new xylene. Methods: Forty fresh specimens were embedded by OCT and were prepared into two equal sequence sections. With recycled xylene and new xylene stain processing, the haematoxylin and eosin (HE)-stained sections were evaluated for tissue structure, cellular and nuclear detail. Results: There were no significant differences in tissue morphology between recycled and new xylene, including tissue structure (t=1.38, P=0.78), nuclear (t=1.45, P=0.82) and cytoplasm (t=1.32, P=0.20) detail. Conclusion: Recycled xylene is suitable for HE staining in routine fast frozen sections.

Xylene; Recovery; Hematoxylin eosin staining; Fast frozen sections; CBG BIOTECH solvent recycler

薛晓伟,女,(1984- ),硕士，技师。中国医学科学院北京协和医院病理科，从事病理技术工作。

1672-8270(2016)11-0136-03

R361

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.039

①中国医学科学院北京协和医院病理科 北京 100730

xiehewangdetian@126.com

2016-07-22