谢仲鹏，李海荣，吴余，何艾桦，肖 归，李新年

结直肠癌是全球发病率位居第三、病死率位居第二的恶性肿瘤[1]。结直肠癌的发生、发展过程复杂，包括染色体不稳定(chromosomal instability, CIN)和微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)等途径[2]，当MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)缺失时可引起MSI，与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。多药耐药(multidrug resistance, MDR)蛋白中的P-gp、GSTπ、TopoⅡ可通过不同的机制降低化疗药物的疗效，是导致化疗失败的原因之一[4]。本实验检测海南地区707例结直肠癌标本中MMR蛋白及MDR蛋白的表达特点，分析MMR蛋白及MDR蛋白与临床病理特征的关系，为结直肠癌患者的治疗及预后判断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料收集海南省人民医院2017年1月～2019年6月诊治的结直肠癌患者707例，其中男性441例，女性266例；年龄25～93岁，平均(61.6±12.6)岁。所有病例临床病理资料均完整，患者术前均未接受化疗或靶向治疗。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，常规制片，HE染色，镜下观察。免疫组化染色采用EnVision两步法，一抗包括MSH2、MSH6、MLH1、PMS2、P-gp、GSTπ、TopoⅡ，所有试剂均购自福州迈新公司。

1.3 结果判定MMR蛋白在肿瘤细胞核表达即判定为阳性，与核染色强弱及细胞多少无关，全部肿瘤细胞核不着色为阴性；任一MMR蛋白表达缺失为错配修复基因缺陷(mismatch repair deficent, dMMR)，MMR蛋白全部阳性为错配修复基因完整(mismatch repair proficient,pMMR)。P-gp阳性定位于细胞膜/细胞质，GSTπ阳性定位于细胞质，TopoⅡ阳性定位于细胞核。P-gp、GSTπ阳性细胞数≤10%为(-)，11%～25%为(+)，26%～75%为()，≥76%为()；TopoⅡ阳性细胞数≤25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，≥76%为Ⅳ级。

2 结果

2.1 结直肠癌中MMR蛋白的表达免疫组化结果显示，MMR蛋白阳性定位于细胞核(图1)，707例结直肠癌中，dMMR 55例(7.8%，55/707)、pMMR 652例(92.2%，652/707)，其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2蛋白表达缺失率分别为2.3%(16/707)、2.4%(17/707)、4.5%(32/707)、5.2%(37/707)；4种蛋白共同缺失者1例(0.1%，1/707)，MSH2与MSH6共同缺失16例(2.3%，16/707)，MLH1与PMS2共同缺失32例(4.5%，32/707)，MSH6单独缺失1例(0.1%，1/707)，PMS2单独缺失5例(0.7%，5/707)。Spearman相关性分析表明，MSH2与MSH6表达呈正相关(rs=0.969，P<0.001，表1)，MLH1与PMS2表达呈正相关(rs=0.927，P<0.001，表2)。

图1 肿瘤细胞MSH2(+)，定位于细胞核，EnVision两步法 图2 肿瘤细胞P-gp()，定位于细胞膜及细胞质，EnVision两步法 图3 肿瘤细胞GSTπ()，定位于细胞质，EnVision两步法 图4 肿瘤细胞TopoⅡ Ⅳ级，定位于细胞核，EnVision两步法

表1 结直肠癌中MSH2蛋白与MSH6蛋白表达的相关性

表2 结直肠癌中MLH1蛋白与PMS2蛋白表达的相关性

2.2 结直肠癌中MDR蛋白与MMR蛋白表达的关系免疫组化结果显示，P-gp(图2)、GSTπ(图3)及TopoⅡ(图4)表达分别位于细胞膜/细胞质、细胞质及细胞核。P-gp(-～)分别占2.4%(17/707)、3.8%(27/707)、47.4%(335/707)、46.4%(328/707)；GSTπ(-～)分别占21.5%(152/707)、11%(78/707)、30.6%(216/707)、36.9%(261/707)；TopoⅡ Ⅰ～Ⅳ级分别占9.4%(66/707)、45.5%(322/707)、40.3%(285/707)、4.8%(34/707)。Spearman相关性分析表明，MSH2、MSH6、MLH1、PMS2表达与P-gp、GSTπ、TopoⅡ表达无明显相关性(P>0.05，表3)。

表3 结直肠癌中MMR蛋白与MDR蛋白表达的相关性

2.3 结直肠癌中MMR状态与临床病理特征的关系dMMR组与pMMR组相比，与患者发病年龄、发病部位、肿瘤大小、分化程度、组织类型、神经侵犯、淋巴结转移等有关(P<0.05)。表现为dMMR组患者发病年龄较早，常发生于右半结肠，肿瘤较大，分化程度低，黏液腺癌多见，较少出现神经侵犯及淋巴结转移。而与患者性别、浸润深度、脉管侵犯等无关(P>0.05，表4)。

2.4 结直肠癌中MDR蛋白表达与临床病理特征的关系本实验以P-gp、GSTπ(-)及(+)为低表达，()及()为高表达；以TopoⅡ Ⅰ级为低表达，Ⅱ～Ⅳ级为高表达。P-gp蛋白表达与组织类型、淋巴结转移等有关(P<0.05)，表现为管状腺癌及淋巴结转移患者较高表达P-gp。GSTπ蛋白表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移等有关(P<0.05)，表现为低分化、浸润较深、有淋巴结转移者较高表达GSTπ。TopoⅡ蛋白表达与发病部位、分化程度等有关(P<0.05)，表现为左半结肠及中低分化患者较高表达TopoⅡ(表4)。

表4 结直肠癌中MMR状态及MDR蛋白表达与临床病理特征的关系

3 讨论

随着人们生活水平的提高，结直肠癌的发病率呈逐年增高趋势，结直肠癌的分子特征与临床病理特征、治疗及预后密切相关，因此全面认识结直肠癌的分子特征尤为重要。

MSI是结直肠癌发生、发展的重要因素之一，对于MSI的重复序列拷贝数检测常用的方法为PCR检测，利用5对引物检测核苷酸重复序列，多于2个位点突变则为高频MSI(MSI-H)，1个位点突变为低频MSI(MSI-L)，无突变则为微卫星灶稳定(microsatellite stoves are stable, MSS)[5]。但PCR技术成本较高，不便于临床常规开展，运用免疫组化法检测MMR蛋白也可以判断MSI的状态，dMMR即MSI-H，pMMR即MSI-L/MSS，MMR与MSI一致率>90%[6]。免疫组化法成本低、耗时少，适用于临床一线筛查。

本实验运用免疫组化法对MMR蛋白进行检测，在707例结直肠癌患者中，dMMR有55例(7.8%)，低于Cheah等[7]报道的9.9%，高于Hu等[8]报道的6.7%。Samowitz等[9]的实验结果显示，MSH2与MSH6的表达呈正相关，MLH1与PMS2的表达呈正相关，因为PMS2只有和MLH1形成复合物才能保持稳定，MLH1缺陷会导致PMS2的继发性缺失；MSH6只有和MSH2形成复合物才能保持稳定，MSH2缺陷会导致MSH6的继发性缺失。dMMR组结直肠癌患者的平均年龄为(54.8±14.9)岁，与文献报道[(56.0±14.6)岁]基本一致。赵喜连等[10-11]分析结果显示，dMMR组患者发病年龄较早、常发生于右半结肠、肿瘤较大、分化程度低、黏液腺癌多见、较少出现神经侵犯及淋巴结转移，与其它报道较一致。

目前结直肠癌的治疗方式为手术切除联合化疗，dMMR患者无法从常规的化疗药物5-氟尿嘧啶中获益，但可以应用抗PD-1/PD-L1单抗或联合抗CTLA-4单抗的免疫治疗方式[12]。另一个导致化疗失败的原因是肿瘤细胞高表达MDR蛋白，P-gp可将肿瘤细胞内的化疗药物泵出细胞外，GSTπ可降解肿瘤细胞中的化疗药物，TopoⅡ参与基因重组、转录和DNA修复，与MDR关系密切[4]。本实验结果显示，管状腺癌及淋巴结转移者较高表达P-gp，中低分化、浸润较深、有淋巴结转移者较高表达GSTπ，左半结肠及中低分化患者较高表达TopoⅡ。Liu等[13]研究结果表明，结直肠癌中P-gp表达与肿瘤浸润深度呈正相关，TopoⅡ表达与淋巴结转移和肿瘤浸润深度呈正相关。而Yu等[14]在胃腺癌中的研究结果表明，GSTπ在男性及高分化者中较高表达，TopoⅡ在高分化者中较高表达，此种差异可能与地域及发病部位不同有关。

综上所述，本实验通过免疫组化法检测结直肠癌中MMR蛋白及MDR蛋白表达情况，发现MMR蛋白及MDR蛋白表达与临床病理特征存在一定关系，对结直肠癌患者的治疗及预后均有重要意义。