邱泰坤 安维婕 何红玉 况凌枫 罗茂丹 蒋立

【摘要】目的：研究芒果苷对不同血凝素（HA）亚型流感病毒吸附及复制过程抑制作用。方法：使用A/Puerto Rico/8/34毒株为骨架，将流感病毒HA基因片段替换为H1、H4、和H7亚型，通过反向遗传技术，构建不同HA亚型的重组流感病毒。使用定量RT -PCR方法检测芒果苷在不同给药方式下病毒复制情况，从而判断该药物对不同HA亚型流感病毒的抑制作用。结果：在病毒吸附过程中加入芒果苷后，使用不合药物的维持液，病毒的复制拷贝数不受影响。然而，在含芒果苷的维持液中，病毒复制的拷贝数明显低于单纯病毒对照组。结论：芒果苷对不同HA亚型的流感病毒的吸附过程没有特异性的抑制作用。其作用靶点可能在病毒进入细胞后的复制过程。

【关键词】芒果苷 流感病毒 血凝素 吸附

一、背景

流行性感冒（influenza，流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染症候群。引起该病的病毒，可分为甲，乙，丙三型。其中甲型流感病毒由于其抗原经常发生变异，且传播迅速，极易造成世界范围的大流行。近年来，有关抗流感病毒中药的研究日益增多，从中筛选有效成分已成为当前新药研发的一个热点。

芒果苷（ mangiferin），又名“莞知母宁”，是一种四羟基毗酮的碳糖苷。现代研究表明芒果苷具有抗炎，抗氧化，抗病毒，保肝利胆，免疫调节，抗糖尿病、抗肿瘤等多方面作用。芒果苷抗病毒活性也得到了部分验证。体外实验研究显示，芒果苷能够抑制HIV-1蛋白酶活性，并具有降低疱疹I、II型病毒对宿主细胞的吸附的作用。体内试验研究显示，芒果苷能够抑制鸭乙肝病毒感染，且停药后不易出现反跳现象。在对抗流感病毒方面，芒果苷能够明显延长小鼠平均存活时间，具有综合抑制流感病毒作用。然而这些研究并没有详细的阐明芒果苷抗流感病毒的分子机制。本研究将针对流感病毒对宿主细胞的吸附及复制过程，使用A/Puerto Rico/8/34 （HIN1，PR8）毒株为骨架，将流感病毒HA基因片段替换为H1、H4、和H7亚型。通过反向遗传技术，统一流感病毒内部基因。使用定量RT-PCR方法对病毒繁殖进行定量分析，从而判断芒果苷对不同HA亚型流感病毒的抑制作用。

二、材料与方法

1.材料

病毒：流感病毒PR8毒株骨架及pHW2000质粒由美国St.JudeChildren Research Hospital，Richard Webby教授惠赠。A/Duck/ShanTou/461/2000 （H4N9）HA基因片段由泰国Mahidol University，Pi-laipan Puthavathana教授惠赠。A/Anhui/l/2013 （H7N9）毒株HA基因片段由中国流感中心舒跃龙教授惠赠。

药物：芒果苷，中国食品药品检定研究院。

2.方法

反向遗传病毒构建：分别将不同亚型HA（H1、H4、H7）克隆到pHW-2000质粒上，再分别与流感病毒PR8的其他7个基因片段质粒，使用TransIT⑩-LTI共转染到联合培养的MDCK和HEK-293T细胞中，获得的重组流感病毒（rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8）将进一步在MDCK细胞中进行增殖。

药物细胞毒性实验

將MDCK细胞接种于96孔板，加入不同浓度的芒果苷，37℃5%CO2孵育72小时后，使用MTT比色法检测其对MDCK细胞的毒性，使用Reed-Iuench法计算半数中毒浓度（TC50）。

病毒感染性测定

将MDCK细胞接种6孔板，病毒行10倍稀释后接种细胞中，使用微晶纤维素作为覆盖系统，培养72小时，然后使用10%福尔马林溶液固定，结晶紫染色液。一个蚀斑代表一个病毒体的繁殖后代品系，对活性病毒颗粒进行定量。

实时荧光RT-PCR（real-time RT-PCR）试验

将病毒培养液使用QIAGEN RNeasy Mini Kit对病毒RNA进行提取。使用QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit -步法real-timeRT-PCR进行反应，反应体积为20μI，使用流感RNP基因通用引物进行病毒核酸扩增，上游引物：5-AGA TI'T CCA CCT GCG ACC G一3;下游引物：5-CAG CGG CTC TCT CCA CAA GT一3。以细胞CAPDH基因为内对照，上游引物：5-GGT GAA CCT CCC TGTCAA CG-3;下游引物：5-CTC CCT CCT CCA ACA TGC TG-3。反应条件为：42。C 5min，95。C lOsec，95。C 5sec，60。C 34sec，共40个循环。采用相对定量的方法，△△Ct=（待测组目的基因Ct值.待测组内参基因Ct值）.（对照组目的基因Ct值.对照组内参基因Ct值），相对含量变化=2-△△Ct。

病毒感染与加药

使用6孔细胞板，分别将重组流感病毒（rgHl-PR8，rgH4 -PR8.rgH7-PR8）以MOI=O.01量与芒果苷0.8mg/ml使用DMEM细胞培养液1ml进行混合，将混合液加入MDCK细胞中，37℃吸附1.5小时，吸去培养液。此时病毒感染的细胞分为两组，其中一组加入不含芒果苷DMEM维持液2ml进行维持，另一组使用含芒果苷0.8mg/ml的DMEM维持液2ml进行维持。维持72小时后，使用real-time RT-PCR对病毒复制情况进行定量分析。

统计方法

采用SPSS软件进行统计学分析，用平均值±标准差（x+s）表示;两两比较用t检验，p<0.05认为差异有统计学意义。

三、结果

知母宁不同加药方式的抗病毒作用

重组流感病毒rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8均能在MDCK细胞中进行复制。根据药物细胞毒性实验测得MDCK细胞对芒果苷半数中毒浓度为2.87mg/ml。本试验使用中浓度0.8mg/ml进行流感病毒拷贝数变化观察。

试验结果显示，所有三个不同HA亚型重组流感病毒在与细胞吸附过程中加入芒果苷后，使用不含芒果苷维持液进行病毒培养（病毒+芒果苷+不含芒果苷维持液），与各自病毒对照组进行比较，病毒拷贝数不存在统计学差异。然而在使用含芒果苷的维持液培养后，病毒的拷贝数明显低于单纯病毒组。

四、讨论

芒果苷至今仍未被开发为临床药物的原因之一是其药理作用泛而弱，定位不突出。本研究围绕流感病毒在细胞中的吸附和复制过程，通过体外实验观察了芒果苷的抗流感病毒的作用。

本研究显示芒果苷对不同HA亚型流感病毒的吸附过程没有特异性的抑制作用，但由于流感病毒的感染过程还包括膜融合、脱壳、核蛋白复合物入核、基因组的复制、组装、出芽和释放等步骤。因此，芒果苷作用的靶点还有待进一步研究。

本研究揭示芒果苷在病毒进入细胞后的复制过程中起到了抑制作用。除了以上提到的病毒自身复制的步骤可能会受到影响外，从宿主细胞层面，芒果苷能对细胞MAPK信号转导通路中ERK、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平的产生影响。由于这些信号通路的活化能够直接影响流感病毒在细胞内的复制。因此芒果苷抗流感病毒的药理机制也需要考虑其对细胞的炎症反应调节机制。

根据上述实验结果，可判断芒果苷对不同HA亚型流感病毒的吸附过程没有特异性的抑制作用，其作用靶点可能在病毒进入细胞后的复制过程。

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基金资助：貴州中医药大学大学生创新创业训练计划项目（贵中医大创合字（2019）-53号）。

作者简介：邱泰坤、安维婕、何红玉、况凌枫、罗茂丹：在读本科生。通讯作者：蒋立（1980-），男，土家族，贵州人，课题指导老师，副主任检验技师，博士，研究方向：中医药抗病毒。