麦秀云 张静 郭乐琴

摘要 目的：研究黃芪联合丹参对多囊卵巢综合征（PCOS）模型大鼠雄激素（AR）及胰岛素受体（INSR）表达的影响。方法：通过对大鼠注射外源性雄激素建立高雄激素无排卵模型，将建模成功的大鼠随机分为黄芪组、丹参组、黄芪+丹参联合组以及模型组，每组10只，分别以黄芪、丹参、黄芪+丹参联合用药行不同干预治疗，模型组用生理盐水灌胃。比较各组大鼠血清雄激素、胰岛素水平;卵巢AR、INSR mRNA及蛋白水平。结果：1）与模型组比较，黄芪组血清睾酮水平明显下降，丹参组血清胰岛素水平明显下降;联合组血清睾酮及胰岛素水平均明显下降。2）与模型组比较，黄芪组INSR蛋白水平明显下降，丹参组INSR蛋白水平明显上升;黄芪+丹参联合组AR蛋白水平明显下降，同时INSR蛋白水平明显升高。3）与模型组比较，黄芪组AR mRNA水平明显下降，丹参组INSR mRNA水平明显上升;黄芪+丹参联合组AR mRNA水平明显下降，同时卵巢INSR mRNA水平明显升高。结论：黄芪可改善PCOS的高雄激素状态，丹参可改善PCOS的高胰岛素状态，联合用药兼具抗雄激素及降低胰岛素的作用，AR、INSR表达的改变是其可能的作用机制之一。

关键词 多囊卵巢综合征;联合;黄芪;丹参;雄激素受体;胰岛素受体;mRNA;蛋白

Abstract Objective：To study the effects of Radix Astragali seu Hedysari and Radix Salviae Miltiorrhizae on the expression of androgen receptor and insulin receptor of rats with polycystic ovary syndrome（PCOS）.Methods：The model of hyperandrogen anovulatory was established by injecting exogenous androgen.Rats successfully modeling were randomly divided into an Radix Astragali seu Hedysari group（n=10），a Radix Salviae Miltiorrhizae group（n=10），a combined group（n=10）and a model group（n=10）.The rats were treated with Radix Astragali seu Hedysari，Radix Salviae Miltiorrhizae and Radix Astragali seu Hedysari+Radix Salviae Miltiorrhizae for different interventions.The rats in the model group were given the same dose of saline by gavage，The levels of serum androgen and insulin，ovarian AR，INSR mRNA and protein levels were compared in each group.Results：Compared with the model control group，1）the serum testosterone level was significantly decreased in the Radix Astragali seu Hedysari group，the serum insulin level was significantly decreased in the Radix Salvia Miltiorrhiza group，and the serum testosterone and insulin levels were significantly decreased in the combined group.2）the level of INSR protein in Radix Astragali seu Hedysari group was significantly decreased，the level of INSR protein in Radix Salvia Miltiorrhiza group was significantly increased，the level of AR protein in the combined group was significantly decreased，INSR protein in ovary was significantly increased in combined group.3）the level of ovarian AR mRNA in Radix Astragali seu Hedysari group was significantly decreased，the level of INSR mRNA in Radix Salviae Miltiorrhizae group was significantly increased，and the level of AR mRNA in combined group was significantly decreased while the level of ovarian INSR mRNA was significantly increased.Conclusion：Radix Astragali seu Hedysari can improve the hyperandrogen state of PCOS，Salvia miltiorrhiza can improve the hyperinsulin state of PCOS.Combination medication has anti-androgen and insulin-lowering effects.The change of AR and INSR expression is one of the possible mechanisms.

Keywords Polycystic ovary syndrome; Combination; Radix Astragali seu Hedysari; Radix Salviae Miltiorrhizae; Androgen receptor; Insulin receptor; mRNA; Protein

中图分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.009

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）确切的发病机制目前尚不清楚，但普遍认为胰岛素抵抗和高雄激素血症是2个主要的病理生理学基础，因此控制高雄激素、纠正异常糖代谢，已成为治疗PCOS的重要方向[1]。临床上分别使用含有黄芪或丹参的方剂，观察结果显示有降雄激素、胰岛素和增加PCOS患者妊娠率的作用[2-3]。但黄芪与丹参两者联合使用对PCOS高雄激素、胰岛素抵抗状态的治疗效果及作用机制，目前尚无报道。本研究拟通过对大鼠注射外源雄激素建立PCOS动物模型，分别以黄芪、丹参、黄芪+丹参联合用药，比较不同干预组、对照组间雄激素及胰岛素抵抗状态的差异，以及卵巢雄激素、胰岛素受体mRNA水平的差异，从对卵巢中雄激素受体（AR）、胰岛素受体（INSR）影响的角度，探讨中药黄芪、丹参对PCOS大鼠模型抗雄激素/改善胰岛素抵抗的效应和作用机制，评估黄芪、丹参及联合应用治疗PCOS的疗效。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级9日龄SD雌性大鼠[广东省实验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2009-0015]，所有动物饲养于本院动物实验中心，饲养条件：温度（22±1.5）℃，湿度（50±2.0）%，以12/12 h为光暗交替周期。

1.1.2 藥物 脱氢表雄酮（SIGMA公司，德国，批号：25102173）;黄芪颗粒（四川百利药业，批号：Z19993381），丹参颗粒（湖北天圣康迪药业，批号：Z19994069）。

1.1.3 试剂与仪器 T（批号：2004121915），INS（批号：201012348）放免试剂盒，购自生物工程有限公司;RNA提取试剂盒（货号：C11730-025），反转录试剂盒（货号：DRR037A），购自美国Invitrogen公司;RT-PCR仪（Appendorf，德国，型号：SimpliAmp）;实时定量PCR仪（ABI，美国，型号：QuantStudio 7）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只SPF级9日龄SD雌性大鼠，按照数字随机法分为空白组（n=10）、模型组（n=50），其中模型组大鼠接受PCOS模型制备，按俞瑾等方法建立动物模型[4]，造模结束20 d后，进行阴道细胞涂片，染色干燥后，显微镜下观察细胞形态的变化确定大鼠动情周期的情况。同时称量造模后大鼠体质量，与正常组比较，以确定建模效果。将建模成功的40只大鼠随机分为黄芪组、丹参组、联合组以及模型组，每组10只。各组大小鼠体质量、鼠龄等方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2.2 干预方法 将造模成功的SD大鼠（n=40）随机分为黄芪组、丹参组、黄芪+丹参联合组、模型对照组4组，每组10只。第29天开始分别以黄芪0.24 g/kg体质量/d，丹参0.4 g/kg体质量/d，黄芪、丹参联合，给予各组相应药物，模型组及空白组大鼠予生理盐水灌胃，1次/d，连续20 d。各组灌胃容积为20 mL/kg。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 血清睾酮、胰岛素水平 干预后每组随机取3只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后取下腔静脉血，采用放射免疫（RIA）法测定血清中睾酮、胰岛素水平，操作步骤按试剂盒说明书。

1.2.3.2 卵巢AR、INSR蛋白表达 干预结束后利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出卵巢组织，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例加入适量1%PMSF蛋白裂解液，匀浆后室温下静置10 min后，用BCA试剂盒测定样本总蛋白，根据结果得出上样量后进行电泳跑胶，转膜，加入AR、INSR及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀释，再进行生物辣根过氧化酶HRP标记的二抗孵育，最后显影、拍摄，用Image（BIO-RAD公司）的图像处理软件进行处理，测定各样本灰度值。

1.2.3.3 卵巢AR、INSR mRNA表达 干预后利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出卵巢组织，匀浆，按RNA trizol试剂盒说明提取总RNA，反转录为cDNA。引物由Takara公司合成，见表1，以β-actin为内参基因。反应体系为20 μL，SYBR Green PCR master mix（Roche）10 μL，cDNA2 μL，正反引物为1 μL。反应条件：95 ℃ 10 min。95 ℃15 s，60 ℃ 1 s，共40个循环。读取Ct（Cycle threshold）值，采用2-△△Ct方法分析结果。引物序列如下：Β-actin上游：TGTCACCAACTGGGACGATA下游：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;AR上游：AGGAGGGCAGATCCTGTCTA下游：ATCCTGCCTCCTCGTCCTCTT;INSR上游：CGGCCCGATGCTGAGAACAAC下游：CCCTTGCCCCTTTCCGATAG。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）描述，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。当P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模效果评估 1）大鼠体质量变化：用药后PCOS组大鼠体质量（201.2±27.5）g，明显高于造模前（132.8±39.83）g，2者比较差异有统计学意义（P<0.05）。2）阴道细胞涂片：40只大鼠阴道涂片始终为动情间期，持续上皮角化，2只大鼠阴道涂片为不规律动情周期，示无排卵。该模型大鼠存在体质量增加、持续无排卵及雄激素增加，是较理想的PCOS动物模型。

2.2 各组血清睾酮、胰岛素水平变化 与空白组比较，模型组血清睾酮及胰岛素水平均明显上升（P<0.05）。与模型组比较，黄芪组、黄芪+丹参联合组血清睾酮水平明显下降（P<0.05）。说明黄芪及黄芪丹参联合用药能降低PCOS大鼠的血清睾酮水平。与模型组比较，丹参组与联合用药组血清胰岛素水平明显下降（P<0.05）。说明丹参及黄芪+丹参联用可降低血清胰岛素水平。而黄芪+丹参联用可以同时降低血清睾酮及血清胰岛素水平。见表1。

2.3 各组卵巢AR、INSR蛋白水平变化 与模型组比较，黄芪组卵巢雄激素受体蛋白水平明显下降，丹参组卵巢胰岛素受体蛋白水平明显上升;黄芪+丹参联合组卵巢雄激素受体蛋白水平明显下降，同时卵巢胰岛素受体蛋白水平明显升高。见图1，表2。

2.4 各组卵巢AR、INSR mRNA水平变化 与空白组比较，模型组卵巢AR mRNA水平明显升高，而INSR mRNA水平明显下降（P<0.05）。与模型组比较，黄芪组、黄芪+丹参联合组卵巢AR mRNA表达水平明显下降（P<0.05），说明黄芪以及黄芪+丹参联合用药可抑制PCOS大鼠卵巢中AR的表达。与模型组比较，丹参组及黄芪+丹参联合组卵巢INSR mRNA表达水平明显上升（P<0.05），说明丹参以及黄芪加丹参联合用药可增强卵巢INSR mRNA的表达。而黄芪加丹参联合用药则可抑制PCOS大鼠卵巢AR基因的表达，同时增强INSR基因的表达。见表3。

3 讨论

PCOS是常见的生殖内分泌疾病，以高雄激素、胰岛素抵抗为主要特征。近年来，PCOS中受体因素的作用吸引了越来越多的关注[5-7]。PCOS许多病理特征都受着AR的影响。高雄激素在女性PCOS中引起的一系列病理生理变化是通过AR实现的。研究表明：雄激素致无排卵模型动物（Androgen Sterilized Rats，ASR）的血雄激素水平升高，上调胰腺、下丘脑及卵巢AR的表达，引起该模型的高LH血症和无排卵[8-9]。

胰岛素抵抗是胰岛β细胞发生代偿效应的表现，是PCOS的糖脂代谢的重要原因之一。当外周组织对葡萄糖进行摄取时对胰岛素的敏感度下降，随之胰岛素的相关生物效应减弱，从而引起血糖升高，应激性得导致机体所需胰岛素量增加，诱发胰岛β细胞分泌过量的胰岛素，故血液中的胰岛素水平上调，出现代偿性的高胰岛素血症[10-12]。研究表明，PCOS患者卵巢颗粒细胞胰岛素受体（Insulin Receptors，INSR）表达异常，可导致胰岛素抵抗/高胰岛素血症，多数PCOS患者因体内激素水平产生改变，影响了脂肪代谢，出现向心性肥胖体态，这亦是PCOS的典型特征之一。有研究表明，胰岛素受体表达异常是胰岛素抵抗发生的重要机制，胰岛素受体在PCOS体内异常降低，这与本研究结果一致，因此上调胰岛素受体的水平，调节糖脂代谢是治疗PCOS的关键[13-15]。胰岛素抵抗与下丘脑-垂体-卵巢轴紊乱息息相关，而下丘脑-垂体-卵巢轴紊乱亦被认为是PCOS的病理特征，二者协同作用，最终导致雄激素上调。有研究显示雄激素受体在窦卵泡中有大量表达，提示雄激素受体的增多影响卵泡的生长发育，同时间接说明雄激素可影响卵泡细胞停留于窦卵泡阶段的时长，雄激素可能阻滞了卵泡细胞的成熟，进而导致PCOS机体生殖能力减弱，故降低雄激素是治疗PCOS的关键[16-19]。

临床上使用含有黄芪或丹参的方剂，有降雄激素和增加PCOS患者妊娠率的作用[20]。对32例PCOS患者联合应用黄芪多糖和达英-35共3个月，观察治疗前后血性激素、胰岛素敏感性及血脂的改變，可以有效改善PCOS患者胰岛素抵抗和高雄激素状态及血脂代谢。但以上少量的临床观察研究均不能解释黄芪、丹参在PCOS中确切的作用机制。本研究发现：与正常组比较，ASR模型组血清雄激素水平和胰岛素水平均明显升高;与正常组比较，模型组卵巢中AR水平显著升高而INSR水平显著下降。说明ASR模型很好地模拟了PCOS的高雄激素/高胰岛素的病理生理变化。分别用黄芪、丹参、黄芪+丹参联合用药对PCOS大鼠进行干预后，发现黄芪、黄芪及丹参联合用药不仅降低PCOS大鼠的高雄激素水平，也降低了其高雄激素受体mRNA水平，但单用丹参则没有明显的降低PCOS大鼠雄激素及雄激素受体表达的作用。丹参、黄芪+丹参联合用药可降低PCOS大鼠的胰岛素水平，升高胰岛素受体mRNA表达水平，但单用黄芪则无改善PCOS大鼠胰岛素抵抗状态的作用。

因此，黄芪和丹参联用可改善PCOS大鼠的高雄激素血症，其可能的作用机制是通过抑制血清雄激素水平和卵巢雄激素受体水平实现;亦可同步改善PCOS大鼠的高胰岛素血症，其可能的作用机制为通过降低胰岛素水平，增强胰岛素受体水平实现的。

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（2019-05-17收稿 责任编辑：芮莉莉）