四逆汤高效液相指纹图谱的建立及含量测定

2020-11-26阮玥林燕张晓燕

世界中医药 2020年20期

阮玥林燕张晓燕

摘要目的：通过高效液相色谱法（HPLC）对四逆汤进行指纹图谱的建立。方法：对HPLC法进行常规的可靠性方法学考察，包括专属性、精密度、稳定性等，然后进一步采用HPLC对四逆汤进行指纹图谱的建立，在此基础上比较10批不同四逆汤样品的相似度，并进行含量测定。结果：1）线性回归考察中结果显示在一定的线性范围内四逆汤中的次乌头碱对照品、6-姜酚对照品、和甘草苷对照品溶液线性关系考察均显示良好。2）乌头碱、6-姜酚和甘草苷在精密度试验、稳定性试验和重复性试验中RSD值分别为0.47%、0.86%、0.39%，2.11%、2.63%、1.95%，1.58%、1.97%、1.02%，均显示四逆汤在HPLC检测中的精密度、稳定性和重复性均较好。3）四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量测定中10个不同批次的四逆汤在3个成分中差异均无统计学意义（P<0.05），其平均测得量为（12.86±0.18）μg/mL、（62.91±0.78）μg/mL、（349.96±0.26）μg/mL。结论：采用高效液相对四逆汤进行指纹图谱的建立和相似度比较分析及含量测定发现，四逆汤的质量稳定性均一，可作为临床疗效的稳定性提供药理学实验依据。

关键词高效液相色谱法;四逆汤;指纹图谱;次乌头碱;6-姜酚;甘草苷;含量测定;药理实验

Abstract Objective：To establish the fingerprint of Sini Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：The routine reliability methodology of HPLC method was investigated，including specificity，precision and stability etc.，and HPLC was used for the establishment of fingerprint of Sini Decoction.On this basis，the similarity of 10 batches of different Sini Decoction samples were compared，and the content was determined.Results：1）The results of linear regression investigation showed within a certain linear range，the linear relationship of the subaconitine reference substance，6-gingerol reference substance，and glycyrrhizin reference substance solution in Sini Decoction showed good results.2）The RSD values of aconitine，6-gingerol and glycyrrhizin in precision test，stability test and repeatability test were 0.47%，0.86%，0.39%，2.11%，2.63%，1.95%，1.58%，1.97% and 1.02%，respectively，which showed that Sini Decoction had good precision，stability and repeatability in HPLC detection.3）In the determination of the contents of sub-aconitine，6-gingerol and glycyrrhizin in Sini Decoction，there was no significant difference among the 3 components in 10 different batches of Sini Decoction，and the average contents were（12.86±0.18）ug/mL，（62.91±0.78）ug/mL and（349.96±0.26）ug/mL.Conclusion：HPLC relative to Sini Decoction was used for the establishment of fingerprints，similarity comparison analysis and content determination found that that Sini Decoction had uniform quality and stability，which could provide pharmacological experimental basis for the stability of clinical efficacy.

Keywords High performance liquid chromatography; Sini Decoction; Fingerprint; Hypaconitine; 6-gingerol; Glycyrrhizin; Content determination; Pharmacological experiment

中图分类号：R284.1 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.003

《伤寒论》中收录了四逆汤，而这一仅由附子、炙甘草和干姜3味药材组成的药方，是以回阳与救逆并重的重要代表方，这个方的药物组成虽然简单，但是药效极其复杂，是中药中七情配伍的典型代表方药。该方中仅以3味药材即体现了中药配伍中的相畏/相杀配伍关系，又体现了中药配伍中相须/相使配伍关系，将中藥配伍中减毒增效的特点体现的淋漓尽致[1]。四逆汤广泛运用于临床各个领域，不仅可以运用于内外妇儿多科病种[2-3]，而且涵盖了心肝脾肺肾五大系统的各种疑难杂症，比如心力衰竭[4]、心肌梗死[5-6]等心脏系统疾病;急性肠胃炎吐泻过度的脾胃系统疾病[7-8];以及诸如休克[9]、肿瘤[10]等疑难杂症。而四逆汤全方以附子为君药，从现代药理学的角度入手，乌头类生物碱为其主要成分[11-12];干姜为臣药，6-姜酚为其主要成分[13];炙甘草是佐使药，甘草皂苷类化合物为其主要成分[14]。高效液相技术是在中药研究中较为成熟的应用技术，而中药指纹图谱能一定程度的反应中药化学成分，通过对药方中单一成分的含量测定来对整个药方进行质量控制。由此本研究通过建立四逆汤的指纹图谱并采集10个不同批次的四逆汤进行相似度比较，同时进行四逆汤成分含量测定，为四逆汤的临床质量控制提供实验研究基础，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪器和色谱系统（上海圣科仪器设备有限公司，型号：LC210），色谱仪器系统包括：色谱柱恒温箱、高压输液泵等;色谱柱（上海添时科学仪器有限公司，型号：C18-AQ，孔径：120 ，规格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;电子分析天平（上海方瑞仪器有限公司，型号：FA1104，最小显示值：0.1 mg）;全自动小型超声波清洗器（山东博科科学仪器有限公司，型号：BK-600VAD）。

1.2 试药由四川省维克奇生物科技有限公司购入的所有对照品，其中甘草苷对照品纯度≥98%（批号：1340404）、次乌头碱对照品纯度≥98%（批号：130509）、6-姜酚对照品纯度≥98%（批号：140124）。HPLC级色谱纯乙腈（MERCK公司，德国，批号：75-05-8）;HPLC级色谱纯甲醇（MERCK公司，德国，批号：67-56-1）;HPLC级色谱纯甲酸（ACS公司，美国，批号：631-61-8）。

1.3 分析药品四逆汤，药物组成有附子30 g、干姜20 g和炙甘草30 g。其中附子产地四川，属于毛茛科植物乌头的子根炮制加工品（批号：YPA4F0001）;干姜产地四川，属于干姜的干燥根茎炮制加工品（批号：GAP200611）;炙甘草产地甘肃，属于甘草的干燥根和根茎（批号：YPA4G0001）。所有藥材均为本院药房提供，每种药材均各取10个不同批次的药材配伍四逆汤，并标记为S1、S2、S3、S4……S10。

2 方法与结果

2.1 色谱条件进样体积为10 μL;色谱柱的的温度控制在25 ℃;流动相A以色谱纯甲醇和超纯水均匀混合而成，流动相B以0.1%色谱纯甲酸和超纯水混合而成;研究中所有高效液相色谱线性梯度洗脱程序均根据表1进行。检测波长设置在230 nm时可以检测到较多的吸收峰。

2.2 对照品溶液配制采用精确度为十万分之一的电子分析天平精密分别精密称取次乌头碱对照品、6-姜酚对照品、甘草苷对照品分别各3.81 mg、9.02 mg、11.66 mg，分别放置在用标签标记好3个对照品名的5 mL容量瓶中，并用色谱纯甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需质量浓度的单一对照品溶液。最终次乌头碱对照品的质量浓度是0.762 g/L、6-姜酚对照品的质量浓度是1.804 g/L、甘草苷对照品的质量浓度是2.332 g/L。将4种对照品溶液取适量混合摇匀后，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液配制

2.3.1 四逆汤供试品溶液配制根据1.3四逆汤药物组成的配比加入10倍超纯水，经过1 h的充分浸泡之后，采用回流提取的方式提取浓缩液1 h，分别提取2次后，采用纱布过滤，合并2次过滤浓缩药液，并加入无水乙醇在50 mL的容量瓶中，先静置24 h后再经过抽滤回收乙醇，最后将无醇味的浓缩药液用超纯水定容，使得最终四逆汤浓缩液的含药量为0.8 g/mL，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对四逆汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为四逆汤供试品溶液。

2.3.2 阴性对照溶液配制首先依次除去一味药材，保留2味药材，（如除附子外可得阴性对照溶液1、除干姜外得阴性对照溶液2，除炙甘草外得阴性对照溶液3），根据1.3中的四逆汤药物组成的配比加入10倍超纯水，经过1 h的充分浸泡之后，采用回流提取的方式提取浓缩液1 h，分别提取2次后，采用纱布过滤，合并2次过滤浓缩药液，并加入无水乙醇在50 mL的容量瓶中，先静置24 h后再经过抽滤回收乙醇，最后将无醇味的浓缩药液用超纯水定容，使得最终四逆汤浓缩液的含药量为0.8 g/mL，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对四逆汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为阴性对照供试品溶液。

2.4 专属性试验采用HPLC法对混合对照品溶液、阴性对照供试品溶液、四逆汤供试品溶液进行专属性试验，本研究结果显示，四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷等3种主要成分均可见良好的分离度，且在各个阴性对照溶液中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷等3种主要成分相应的保留时间里均无吸收峰，显示本高效液相研究方法的专属性均较好。

2.5 线性关系考察根据对照品溶液配制方法将次乌头碱对照品、6-姜酚对照品、和甘草苷对照品溶液分别根据从低浓度到高浓度的梯度，采用甲醇配制6个浓度梯度的对照品溶液，每一个浓度均测试4次，记录色谱峰面积并计算平均值和绘制回归方程，方程中纵坐标Y是各对照品的平均峰面积，横坐标X是各对照品对应的浓度梯度，结果显示在一定的线性范围内四逆汤中的次乌头碱对照品、6-姜酚对照品、和甘草苷对照品溶液线性关系考察均显示良好。见表2。

2.6 精密度试验在精密试验中将取同一批次同一时间配制的四逆汤供试品溶液连续进样6次，连续检测次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量并换算其各自对应的RSD值，结果显示乌头碱、6-姜酚和甘草苷的的RSD值分别为0.47%、0.86%、0.39%，符合当精密试验中RSD值小于3%时，即说明高效液相色谱仪器的精密度良好，适宜采用高效液相色谱法为四逆汤建立指纹图谱。

2.7 稳定性试验在稳定性试验中，选择某一个批次所配置的四逆汤供试品溶液，将该份四逆汤供试品溶液分为6份，并依次标记相应的静置时间，依次为0、2、4、8、12、24 h，然后根据时间的从短到长的顺序检测四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量并换算各成分的RSD值。结果显示次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的RSD值分别为2.11%、2.63%、1.95%，符合当稳定性试验的RSD值小于3%时，即说明四逆汤供试品溶液在静置24 h内采用高效液相测试，其结果均能保持良好的稳定性。

2.8 重复性试验在重复性试验中，待测样品必须保证是6份同一批次同一制备方法制备的四逆汤供试品溶液，必须试验使用同一台高效液相色谱仪器及相同的色谱条件重复测试该供试品溶液，检测四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量并换算各成分的RSD值。结果显示次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的RSD值分别为1.58%、1.97%、1.02%，符合当重复性试验RSD值小于3%时，即说明采用高效液相色谱法检测四逆汤供试品溶液能够保持良好的重复性。

2.9 回收率试验在加样回收率试验中，将含量已知的四逆汤供试品溶液分成6个等份，每一份均加入等量的对照品溶液，混合均匀后对混合液和各个对照品溶液分别重复检测6次，检测四逆汤供试品溶液中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的平均回收率。结果显示次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的平均回收率分别为（95.88±2.30）%、（97.28±3.20）%、（96.12±3.10）%，说明采用高效液相色谱法建立四逆汤供试品溶液的指纹图谱及测试其中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量是可靠的。

2.10 样品检测结果

2.10.1 四逆汤高效液相指纹图谱建立首先通过高效液相指纹图谱建立四逆汤的对照指纹图谱，见图1，并以9号峰为参考峰（甘草苷），因为9号峰的峰面积和分离度都比较稳定，辨识度高，因此将其作为本研究的参考峰，进而对10个不同批次的四逆汤进行指纹图谱相似度分析，结果显示10个不同批次的四逆汤指纹图谱相似度均大于0.8。见图2，表4。

2.10.2 四逆汤的含量测定四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量测定中10个不同批次的四逆汤在3个成分中差异均无统计学意义（P<0.05），其平均测得量为（12.86±0.18）μg/mL、（62.91±0.78）μg/mL、（349.96±0.26）μg/mL。见表5。

3 讨论

中药指纹图谱是指某些中藥材或中药制剂或中药配方在经过适当处理后，采用一定的分析手段（比如高效液相色谱法），得到的能够标示该中药材/中药制剂/中药配方的化学特征的色谱图或光谱图[15-16]。因此在药理学研究中中药指纹图谱是一种综合的，可量化的药理学分析鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价该中药材/中药制剂/中药配方或中药新药研究的半成品质量的真实性、药品或药方的稳定性[17-18]。在四逆汤的研究中，多少研究是对组方中单一药材的单一成分或多成分分析，鲜少对四逆汤进行指纹图谱的建立，因此本研究基于中药指纹图谱这一分析手段对四逆汤进行指纹图谱的建立，10批不同批次四逆汤相似度的分析以及主要成分含量的测定。在四逆汤高效液相色谱法指纹图谱的建立过程中，首先在色谱条件的流动相体系条件摸索中，在选用流动相体系为pH=10的0.1%醋酸铵溶液——乙腈进行分析，结果仅出现较少的色谱峰，且有细小结晶析出，导致高效液相色谱柱堵塞;紧接着研究前期又改用流动相体系0.1%甲酸水溶液——乙腈后，尽管这个色谱条件下能获得较多色谱峰，但是各个色谱峰之间的分离度不好，且无法通过调整洗脱梯度得到改善;而当课题组将流动相体系改设置为0.1%甲酸水溶液——甲醇的时候，得到了相对平稳的基线图，而且不仅有较多峰形较好的色谱峰数目，各个色谱峰的分离度良好，辨识度良好，且色谱峰的对称性也良好。因此本研究即采用0.1%甲酸水溶液——甲醇作为流动相体系进行指纹图谱的建立。研究中通过高效液相色谱法对四逆汤进行指纹图谱的建立合10个不同批次四逆汤相似度分析，结果显示10个不同批次的四逆汤指纹图谱相似度均大于0.8，相似度较高。为了进一步研究四逆汤的含量情况，对四逆汤进行含量测定，结果显示，四逆汤中次乌头碱、6-姜酚和甘草苷的含量测定中10个不同批次的四逆汤在3个成分中差异均无统计学意义，更进一步从药理学角度证实了四逆汤疗效的稳定性。

参考文献

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