黄羚 刘铁钢 白辰

摘要 目的：挖掘谷曉红教授治疗小儿急性上呼吸道感染的组方用药规律，分析组方可能存在的药物靶标及相互作用，探索核心药物的作用机制。方法：收集谷晓红教授医案数据库中小儿急性上呼吸道感染的医案，采用中医传承辅助平台软件分析药物间的关联规则，挖掘核心药物及新方组合;运用SPSS软件对药物的性味归经进行系统聚类分析;运用TCMSP、String及KEGG数据库分析新方组合各药物靶标间相互作用关系及相关通路。结果：在筛选出的164首处方中，挖掘出2个核心药物组合和2首新方组合，总结出性味归经相近的6个高频药群，得到新方组合活性成分195个，相关药物靶标1 406个，急性上呼吸道感染靶标31 312个，药物-疾病交集靶标1 385个，其中核心靶标300个。这些靶标构成的网络中共存在相互作用4 430项、相关通路25条（P<0.001），其中与呼吸系统关系最密切的是细胞凋亡、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路，新方组合核心靶标52个。结论：谷晓红教授治疗小儿急性上呼吸道感染以辛凉透表、和胃化湿法为主，其机制可能是通过调控细胞凋亡，调控炎性反应及免疫应答等多靶标复杂通路的共同干预实现。

关键词 数据挖掘;网络药理学;用药规律;经验方;小儿急性上呼吸道感染;辛凉透表;和胃化湿;炎性反应及免疫

Abstract Objective：To explore the medication rule of Professor GU Xiaohong′s treatment of pediatric acute upper respiratory infection（AURI），to analyze the interactions of drug targets in the component，and to explore the core mechanism of drugs.Methods：Cases of AURI from Professor GU Xiaohong′s medical record database were collected，and Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System（TCMISS）was used to analyze the association rules between drugs，core drugs and new component were mined.SPSS software was used to carry out systematic clustering analysis on the nature and flavor and channel tropism of drugs; TCMSP，String and KEGG database was used to analyze the interaction between the drug targets of the new prescription combination and related pathways.Results：A total of 164 prescriptions were selected，2 core drug combinations and 2 new prescriptions were explored.6 high-frequency drug groups with similar nature and flavor and channel tropism were summarized，and 195 active ingredients of the new prescription combination were obtained，with 1 406 related drug targets，and 31 312 targets for acute upper respiratory infections.The matching targets of drug-disease was 1 385，of which 300 were core targets.There were 4 430 interactions and 25 related pathways（P<0.001）in the network composed of these targets.Among them，the most closely related to the respiratory system were apoptosis，T cell receptor signaling pathway，MAPK signaling pathway，and Toll-like receptor signaling pathway.Xinfang combination 52 core targets Conclusion：Professor GU Xiaohong generally used principle of resolving exterior with pungent and cool natured drugs，regulating stomach and dissipating dampness to treat AURI.The mechanism may be achieved by co-intervention of multiple target complex pathways，such as regulating apoptosis，inflammatory response and immune response.

Keywords Data mining; Network pharmacology; Medication rules; Experienced formula; Pediatric acute upper respiratory infection; Resolving exterior with pungent and cool natured drugs; Regulating stomach by dissipating dampness; Inflammatory immunity

中图分类号：R242;R272 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.001

小儿急性上呼吸道感染是儿科常见疾病，可参照中医“小儿感冒”“风温”“发热”“咳嗽”等论治。小儿急性上呼吸道感染是由各种病原引起的上呼吸道炎性反应，临床以鼻、咽部局部炎性反应和全身症状为特征，主要病原体是病毒。西医并无理想特效治疗药物，故中医治疗该病具有一定的优势。本研究使用中医传承辅助系统软件挖掘谷晓红教授治疗小儿感冒的用药规律，运用网络药理学方法探讨其新方组合治疗小儿感冒的作用机制，希冀提高小儿感冒的临床疗效，为进一步研究提供参考。

1 資料与方法

1.1 医案来源 选取2010年1月1日至2018年5月31日北京中医药大学国医堂谷晓红教授门诊就诊患者病历资料，共录入医案164例。

1.2 诊断标准 西医诊断标准：参照《临床诊疗指南：小儿内科分册》[1]。中医诊断标准：主诉为发热恶寒、鼻塞流涕、喷嚏等症，多兼咳嗽，可伴呕吐、腹泻或高热惊厥[2]。

1.3 纳入标准 1）6个月≤年龄≤14岁，排除重大疾病及药物过敏史;2）医案记录的主诉、症状体征符合中、西医诊断标准;3）包含主诉、症状体征、四诊信息、辨证、方药及随诊等内容;4）医案处方为记录完整的自拟方或经验方或符合药典标准的经方。

1.4 排除标准 1）重复医案;2）无随诊记录。

1.5 分析软件 运用中医传承辅助软件（Traditional Chinese Medicine Inheritance Support System，TCMISS）分析用药规律。运用统计产品与服务解决方案（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）软件分析药物聚类。运用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）预测药物靶标。运用人类表型术语集（Human Phenotypeontology，HPO）、DrugBank数据库、毒性与基因比较数据库（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）预测疾病靶标。运用STRING蛋白质数据库（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，String）构建药物-疾病靶标的网络关系，分析GO功能。运用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，分析通路的相关性。

1.6 录入方法 采用双人审核制录入TCMISS软件，使用“方剂分析”功能，分析谷晓红教授治疗小儿感冒的用药规律。

1.7 用药规律分析

1.7.1 频次分析 将纳入医案的单味药用药频次及药物的性味归经属性由大到小排序。

1.7.2 药物聚类分析 药物的性味归经参照《中华人民共和国药典》，将频次≥11的38味药的四气（寒、凉、温、热、平）、五味（酸、苦、甘、辛、咸、淡）、归经（肝、心、脾、肺、肾、胆、小肠、胃、大肠、膀胱、三焦及心包经）进行聚类分析，聚类方法为组间距离，距离类型为欧氏距离平方。

1.7.3 用药规律分析 支持度设为40.0%，支持度个数设为64，置信度设为0.8，使用“规则分析”功能得出用药组合之间的关系。

1.7.4 新组方分析 以“相关度为5，惩罚度为4”进行聚类分析;基于复杂系统熵聚类算法，预测药物核心组合;基于无监督熵层次聚类算法，预测新组方。

1.8 处方机制分析

1.8.1 药物及疾病靶标构建 在TCMSP数据库中，得到新组方药物的靶标。在HPO、Drugbank、CTD数据库中，得到小儿急性上呼吸道感染的靶标，并通过全球蛋白质资源数据库（Universal Protein，UniProt）翻译成相应基因。

1.8.2 药物-疾病靶标的相互作用构建 将交集后的新组方-小儿急性上呼吸道感染靶标在STRING中搜索，针对相互作用靶标PPI计算网络特征值，以“节点连接度（degree）”的2倍中位数为卡值，提取药物-疾病基因互相作用网络的核心节点。

1.8.3 谷晓红教授治疗小儿感冒新组方的可能作用机制 在STRING平台进行GO生物过程富集分析，可以获得靶标基因或蛋白质的分子功能、细胞内定位及其所参与的生物学反应和通路，以P<0.05进行靶标筛选，并将P值排名靠前的通路展示在结果中，预测谷晓红教授治疗小儿感冒的可能作用机制。

2 结果

2.1 用药频次 164首处方共使用109味中药，其中芦根使用132频次，是使用频次最多的药物，以后依次是桑叶、陈皮、前胡、桑白皮、莱菔子等。见表1。

2.2 药物属性 109味中药中，性寒的药味最多，占52.34%;属苦的药味最多，占33.08%;归肺经的药味最多，占39.28%。见表2。

2.3 药物聚类分析 治疗小儿感冒的高频药物可从性味归经属性聚类为6个药群及2个单味药。6个药群依次是：1）性味甘寒、归肺经的金银花、芦根、忍冬藤、白茅根、桑白皮、桑叶;2）性寒、归肺经的浙贝母、连翘、前胡、鱼腥草、牛蒡子、枇杷叶、桔梗;3）性味辛凉、归肺经的淡豆豉、薄荷;4）性味辛温、归肺经的苏梗、紫苏叶、辛夷、荆芥穗;5）性味辛甘、归肺、胃经的莱菔子、炒麦芽;6）性味甘温，归脾、经的焦神曲、焦山楂、炒白术。2个单味药为单独成群的僵蚕、杏仁。见图1。

2.4 基于关联规则的组方规律分析 在置信度较高的药物组合中，显示芦根-白茅根、芦根-桑白皮-桑叶等为常用药物组合。按出现频次由高到低排序，分析所得的药对和药物组合的用药规律。见表3。

2.5 基于熵聚类算法的组方规律分析

2.5.1 药物间关联度分析 组方中有5 685条关联度，将关联系数0.04以上的药对列表，共22条。见表4。

2.5.2 药物核心组合分析 金银花、荆芥穗、淡豆豉及炒白术、白扁豆均出现在2个核心组合中，不同在于核心组合1有连翘和莱菔子，核心组合2有忍冬藤和生姜，以此为基础预测新方组合。见表5。

2.5.3 新方组合分析 分析得到辛凉透表和和胃化湿2个类型的新方组合。见表6。

2.6 相关作用靶标数据库的构建 通过检索，得到新方组合的活性成分为195个，全方的靶标为1 406个，急性上呼吸道感染的靶标为31 312个，经交集显示，药物—疾病交集靶标为1 385个，其中核心靶标为300个。见图2。

2.7 各靶标間的相互作用 通过STRING数据库分析，各靶标间共存在4 430项相互作用，其中关系最紧密的76项。见表7。

2.8 新方组合治疗小儿感冒的GO基因功能及KEGG通路富集分析 新方组合治疗小儿感冒的药物靶标与疾病靶标功能结果见表8。结果显示，其GO基因功能涉及：调控细胞增殖、对有机物的反应、调控细胞凋亡、对内源性刺激的反应、调控细胞程序性死亡、分子功能的正向调控、调控细胞死亡、凋亡的负向调控、细胞程序性死亡的负向调控、细胞死亡的负向调控、对激素刺激的反应、细胞增殖的正向调控、对有机环物质的反应、损伤反应、多细胞有机体过程的正向调节、稳态过程、催化活性的正向调控、对类固醇激素刺激的反应、系统过程的调节、细胞内信号级联等。

通过KEGG数据库对靶标进行通路分析，得到相关通路25条（P<0.001）。这些通路中，与急性上呼吸道感染最为密切的信号通路包括4条：细胞凋亡、T细胞受体信号通路、Toll受体信号通路、MAPK信号通路。见表9。

3 讨论

3.1 谷晓红教授治疗小儿感冒的用药规律 本研究得出谷晓红教授在治疗小儿感冒时以桑叶、芦根、陈皮、桑白皮、前胡等清热理肺气药为主，性寒、味苦、归肺经的药物使用频次最高，总体可归纳为6大药群：依次是：1）性味甘寒、归肺经的清肺热、护津液之品;2）性寒、归肺经的清热解毒，消痈散结之品;3）性味辛凉、归肺经的芳香透邪之品;4）性味辛温、归肺经的解表疏散之品;5）性味辛甘、归肺、胃经的宣降气机之品;6）性味甘温，归脾、经的甘温除热，和胃消食之品。临床常用芦根-白茅根、桑白皮-桑叶等药对以及芦根、桑白皮、桑叶等常用组合，提示谷晓红教授治疗小儿感冒重视辛凉透表，清肺护胃。

谷晓红教授常以肺胃同治治疗肺系疾病。小儿感冒属于温邪范畴，“温邪上受，首先犯肺”，“上焦病不治，则传中焦，胃与脾也”，可见本病病位在肺，与脾胃紧密相关。以恶寒发热、少汗、头痛为主，则病在卫分;以发热为主，不恶寒，伴大烦渴、大汗、大便干，则病在气分，临床常见卫气同病。吴鞠通《温病条辨》中描述儿童的生理是“稚阴未充，稚阳未长”，有“易虚易实，易寒易热”的病理特点。幼儿形气未充，脏腑娇嫩，卫气薄弱，易外感六淫邪气，急易传变;脾常不足，运化失调，水反为痰湿，谷反为食滞，故小儿感冒易夹痰、夹滞;复伤脾胃，脾胃为后天之本，脾胃不足则正气耗损，母病及子，肺气虚损，卫外不固，抗邪无力，祛邪无能。儿童饮食多样化，自我控制力弱，又常受到家中长辈的过分关注，反而导致其喂养不当，饮食不节，则易伤食。中焦升降失调而成积滞，积滞郁久化热，素体有热者，寒邪易从热化，致温邪表里同病，使小儿感冒证热者居多，实证者多于虚证者。故治疗上以肺胃同治立法，予以辛凉透表，清肺护胃。

临床上治疗小儿风热感冒的推荐常用方剂是银翘散，以辛凉解表立法，由金银花、连翘等清热解毒之品，牛蒡子、荆芥等疏散邪之品，薄荷、淡豆豉等芳香行气之品组成，被称为辛凉平剂。谷晓红教授认为银翘散遣方精妙、临床实用，故宣上时以银翘散辛凉透表为基础治疗上焦肺，结合临床上儿童脾常不足、胃常积热的实际情况，加入调护脾胃、调畅胃肠之品，以肺胃同治立法宣上调中，使肺气降、脾气升、胃腑通。吕国凯等[3]的临床研究发现，运用谷晓红教授的肺胃同治法代表方银莱汤治疗小儿肺胃积热型感冒，能有效改善发热、咳嗽、有痰滞、鼻塞、流黄稠涕、鼻衄、咽红、睡眠不安、手心热、面色少华、舌红、苔黄厚等症状。实验证实，运用肺胃同治法代表方银莱汤干预食积复合流感病毒幼鼠模型，可有效改善小鼠的黏膜免疫功能从而提高抗病毒能力[4]。

上述研究处于药效学层面证实谷晓红教授运用肺胃同治法指导小儿急性上呼吸道感染疗效显著，而其组方的活性成分的研究仍是一片空白，且其作用机制的研究尚未深入。故我们借助中医传承辅助平台基于层次聚类和新方聚类分析，生成了以连翘、金银花、荆芥穗、淡豆豉、忍冬藤辛凉透表为核心，辅以炒白术、白扁豆、莱菔子、生姜等和胃化湿的新组方。为更进一步地研究组方多层次、多环节的相关性，我们使用网络药理学方法，获得组方中药成分、疾病靶标等信息，能够客观揭示中药药效物质基础，配伍的协同作用，活性成分多靶点生物效应机制，及药物作用于疾病的基本分子机制，最终形成“组方-药物-靶标-通路”网络。

3.2 新方组合治疗小儿感冒的作用机制 应用网络药理学方法，得到新方组合的活性成分为195个，靶标为1 406个，急性上呼吸道感染的靶标为31 312个，经交集显示，药物-疾病交集靶标为1 385个，其中核心靶标为300个。这些靶标构成的网络中共存在相互作用4 430项、相关通路25条，其中与呼吸系统关系最密切的4条，小儿感冒组方核心靶标52个。以此作为原始数据分析，我们发现小儿感冒组方治疗小儿急性上呼吸道感染的机制可能与细胞凋亡、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路。细胞凋亡、T细胞受体信号通路皆被证实与炎性反应反应、病毒免疫都密切相关。小儿急性上呼吸道感染的病原体中病毒占了约90%[1]。鼻病毒、冠状病毒、肠道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等病毒侵犯上呼吸道的不同部位诱发细胞凋亡从而引起炎性反应反应。实验发现，中药可通过调控细胞凋亡防止病毒增殖，减轻流感病毒感染[6]。故针对细胞凋亡进行治疗或许能成为治疗小儿急性上呼吸道感染的一个新兴方法。T细胞受体是T细胞表面能够特异性识别抗原的分子，在介导免疫应答过程中起重要的作用。T细胞受体有TCRαβ和TCRγδ 2种类型。Dong等[5]研究表明，在单纯疱疹病毒引起上呼吸道感染患者中，T细胞受体BV家族的CDR3增生，可能在机体抵抗病毒感染的免疫应答中具有重要作用。MAPK信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，MAPK有4个重要的亚族：ERK、P38、JNK和ERK5，其中，P38MAPK被证实可介导炎性反应[6]，因而成为抗炎药物研究的常用通路。季坤等[7]认为祛风宣肺中药可能通过P38MAPK信号通路改善气道神经源性炎性反应，提高感染后咳嗽的治愈率。Toll样受体是表达于细胞膜表面跟免疫系统识别微生物有关的一类模式识别受体，在树突状细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞均有表达，被认为是病原微生物的主要识别受体[8]。Toll受体能够刺激T淋巴细胞的增殖，有利于产生细胞免疫应答，参与机体急性上呼吸道炎性反应反应的病理生理过程[9]。Toll受体能够激活胞内转录因子NF-κB，引起促炎因子IL-6、IL-1、TNF-α和IL-12分泌，从而介导免疫[10]。Fransson等[11]发现鼻炎患者的TLR2、TLR4高表达，推测Toll受体参与鼻腔黏膜免疫炎性反应反应从而发挥抗感染作用。

研究表明，组方类似的复方感毒清颗粒可能通过调控Toll样受体信号通路关键靶点TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TRAF6、IRF3、IRF7、IRF8、c-Jun、NF-κB蛋白的表达治疗上呼吸道感染[12]。团队前期的研究结果表明，胃肠积热大鼠幼鼠呼吸道感染后肠组织MyD88、MD2、NF-κB、IkBα低表达，TLR9表达升高，同时肠道菌群紊乱[13-14]。推测胃肠积热证态下的菌群失调可能引起益生菌竞争使致病菌致病能力更集中[15]，激活肠道Toll受体模式识别受体蛋白，引起机体免疫-炎性反应反应进一步加重机体炎性反应。网络药理学得出的小儿感冒新方组合可能作用机制与目前的相关实验研究结果较为一致，提示研究者Toll样受体与呼吸道疾病关系密切，Toll受体信号通路可作为研究急性上呼吸道感染治疗的新靶点。

3.3 总结与展望 本研究运用数据挖掘和网络药理学方法，总结了谷晓红教授治疗小儿急性上呼吸道感染用药规律、组方规律并生成了新组方，初步探讨去配伍关系，并探索了新组方可能存在的作用机制。本研究结果与目前的相关实验研究结果较为一致，可为小儿感冒组方作用机制的深入研究提供理论依据，为进一步开发急性上呼吸道感染治疗的新靶点提供思路。由于医案存在个体化差异，专家经验存在局限性，仅以数据分析谷晓红教授治疗小儿急性上呼吸道感染的内在基础是片面化的。因此，下一步我们应该展开大样本、多维度的临床观察、实验研究来验证数据平台算法下的谷晓红教授治疗小儿急性上呼吸道感染的用药规律及作用机制，从而更加系统科学地阐述小儿急性上呼吸道感染的治疗方法，提高小儿急性上呼吸道感染的临床疗效。数据挖掘和网络药理学方法相结合，可以有效获得基于中医基础的专家经验数据化、可视化分析结果，为临床治疗提供参考依据，同时为经验方的研究开发提供借鉴。

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（2019-04-27收稿 责任编辑：芮莉莉）