毛鑫 徐玉辉 姚荣妹

摘要 目的：筛选王不留行治疗尿路感染的有效部位，并研究有效部位对膀胱组织IL-1β的影响。方法：选用SD大鼠，以膀胱注射大肠杆菌标准株（ATCC 25922）的方法建立尿路感染模型，大鼠造模后给予王不留行醇溶部位及醇沉部位，给药5 d后通过检测尿液中的细菌数及膀胱组织病理学染色评价其有效性;取有效部位给药后的膀胱组织，检测组织中白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA及蛋白的表达。结果：王不留行醇沉部位可明显降低大鼠尿液细菌阳性率，减轻膀胱组织炎性浸润，可明显降低大鼠膀胱组织中IL-1β mRNA及蛋白的表达。王不留行醇沉部位的主要成分为多糖。结论：王不留行多糖提取物为其治疗尿路感染的有效部位。

关键词 尿路感染;王不留行;多糖;白细胞介素-1β;大肠杆菌;膀胱炎;有效部位;水提醇沉

Abstract Objective：To screen the effective parts of Vaccaria segetalis in the treatment of urinary tract infection，and and to study the effects of effective parts on IL-1β of bladder tissue.Methods：SD rats were used to inject the standard strain of Escherichia coli（ATCC 25922）into the bladder to establish a urinary tract infection model.After the rats were modeled，they were given the alcohol-soluble part and the alcohol-precipitated part of Vaccaria segetalis.The number of bacteria in urine and histopathological staining of the bladder were detected to evaluate its effectiveness; the bladder tissue after administration of the effective part was taken to detect the expression of interleukin-1β（IL-1β）mRNA and protein in the tissue.Results：Vaccaria segetalis′s alcohol precipitation site can significantly reduce the positive rate of urine bacteria in rats，and the inflammatory infiltration of bladder tissue，and can significantly reduce the expression of IL-1β mRNA and protein in rat bladder tissue.The main component of Vaccaria segetalis′s alcohol precipitation site is polysaccharide.Conclusion：Vaccaria segetalis polysaccharide extract is an effective part of treating urinary tract infection.

Keywords Urinary tract infection; Vaccaria segetalis; Polysaccharide; Interleukin-1β; Escherichia coli; Cystitis; Effective part; Water extraction and alcohol precipitation

中圖分类号：RR285.5;R242 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.005

尿路感染（Urinary Tract Infections，UTIs）是临床常见的细菌感染性疾病，大肠杆菌是引起的UTIs最主要的病原体，其感染占总病例的80%以上[1-2]。临床上治疗UTIs首选抗生素疗法，近年来随着抗生素滥用，大肠杆菌的耐药菌基因（特别是超广谱β内酰胺酶类ESBLs）不断传播，导致临床一线抗生素的治疗效果大打折扣[3-4]。因此寻找抗生素的替代疗法成为目前研究的热点。

传统中药王不留行是来源于石竹科植物麦蓝菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke的干燥成熟种子，具有活血通经、下乳消肿、利尿通淋之功效，临床可用于治疗血瘀经闭、乳汁不下以及淋症涩痛等症[5]。早期研究[6]发现，王不留行的提取物在大鼠和小鼠体内可以改善良性前列腺增生的症状，而前列腺增生属于中医理论的“窿闭”和“淋证”[7]。本课题组根据前期实验，从同属于中医“淋证”范畴的UTIs入手，进一步完善王不留行治疗“淋证”的科学内涵。通过对王不留行治疗UTIs的有效部位进行筛选，从而为王不留行治疗UTIs的新药开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 王不留行醇沉部位（SVCP）：浅咖啡色粉末（批号：1107）;王不留行醇溶部位（SVE）：深棕色粉末（批号：1107）。阿莫西林（阳性药）（哈药集团制药总厂，批号：A1611005）。

1.1.2 动物 SD大鼠，SPF级，雄性，130只，体质量180～200 g，中国医学科学院医学试验动物研究所提供，动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。实验场地为中国中医科学院中药研究所ABSL-2生物安全实验室。实验中所有操作均遵循NIH及北京市实验动物伦理委员会的规定。

1.1.3 细菌 大肠杆菌标准株（ATCC 25922），购自美国模式培养物集存库ATCC，由中国中医科学院中药研究所ABSL-2生物安全实验室传代，-80 ℃保存备用。

1.1.4 试剂 LB培养基（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：20171209）;水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20151217）;麦康凯琼脂培养基（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：20170915）;Trizol（Ambion公司，美国，批号：149105）;RIPA裂解液（上海碧云天生物技术公司，批号：033018180409），BCA蛋白浓度检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，批号：PLL-2016-05），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180613），超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术公司，批号：012618180413）;一步法RT-PCR检测试剂盒（Takara Bio公司，日本，批号：AH97893A）。

白細胞介素-1β（IL-1β）蛋白抗体（Abcam公司，英国，货号：ab9722）;β-actin蛋白抗体（Proteintech公司，美国，货号：6008-1-Ig）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（Proteintech公司，美国，货号：SA00001-2）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体（Proteintech公司，美国，货号：SA00001-1）

1.1.5 引物 引物由北京科奥鼎盛生物科技有限公司合成，IL-1β基因上游：TCGTGCTGTCTGACCCATGT;IL-1β基因下游：AGGCCACAGGGATTTTGTCG;β-actin基因上游：TATCCTGGCCTCACTGTCCA;β-actin基因下游：AAGGGTGTAAAACGCAGCTC。

1.1.6 仪器 生物安全柜（Thermo公司，美国，型号：A2）;电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，德国，型号：BSA3202S-CW）;低温高速离心机（Eppendorf公司，德国，型号：5810R），多功能酶标仪（PerkinElmer公司，德国，型号：Enspire）;化学发光凝胶成像系统（Proteinsimple公司，美国，型号：FluorChem FC3）;实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，美国，型号：ABI7500）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 SD大鼠130只，按体质量随机分为正常组、模型组、阳性药阿莫西林组（0.18 g/kg）、SVCP 5个剂量组（0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg）、SVE 5个剂量组（0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg），每组10只。大鼠禁食水过夜后，每只大鼠按照1 mL/100 g腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉。麻醉后暴露膀胱，除正常组同等条件下向膀胱注射生理盐水外，其余各组向膀胱内注入0.3 mL大肠杆菌菌液（1×108 CFU/mL），缝合腹壁切口。

1.2.2 给药方法 手术后3 h开始按照1 mL/100 g体质量灌胃给药，连续给药4 d，正常组和模型组同等条件下给与蒸馏水。给药4 d后麻醉大鼠，无菌条件下抽取膀胱液并摘取膀胱组织，把0.1 mL穿刺液接种于麦康凯培养基上，恒温培养箱37 ℃培养过夜，观察记录菌落生长情况，记录阳性率。

1.2.3 HE染色方法 取膀胱组织使用10%福尔马林固定，48 h后取出流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察大鼠膀胱组织有无病理形态学改变，每个膀胱组织取2个视野，进行组间比较。

病理分级：“-”：大鼠膀胱浆膜面未见有炎性反应、水肿，黏膜面移行上皮未见有病变，肌层未见炎性反应、肿胀，结构正常。“+”：大鼠膀胱浆膜面未见有明显炎性反应、水肿，黏膜面上皮未见有明显病变，肌层下有轻度瘀血。“++”：大鼠膀胱浆膜面未见有明显炎性反应，背膜有轻度增厚;黏膜面移行上皮有轻度移行性变，黏膜有局限性轻度炎性反应，以淋巴细胞、中性细胞为主，有轻度瘀血。“+++”：大鼠膀胱浆膜面有炎性浸润，以中性细胞为主，组织有肿胀，血管内有瘀血;黏膜面、移行上皮有退行性变，细胞变小，并有空泡变。黏膜下大面积炎性反应、瘀血，组织有肿胀。

1.2.4 RT-PCR检测 取膀胱组织，Trizol法提取总RNA。使用一步法RT-PCR检测试剂盒，按说明书要求配制反应体系加入八联管，放入实时荧光定量PCR仪，按试剂盒说明设置反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，40个循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s），并开始检测。

1.2.5 Western blot检测 取膀胱组织，RIPA裂解提取总蛋白，BCA法检测蛋白含量并调平浓度，SDS-PAGE凝胶分离并转膜后依次孵育一抗和二抗，显色后于化学发光凝胶成像系统检测蛋白信号，检测结果使用imageJ软件分析灰度值。

1.3 统计学方法 RT-PCR检测结果Ct经过2-△△Ct处理。阳性率比较采用Chi-Square test，病变分级比较采用Mann-Whitney test，其余采用Unpaired t test进行统计学处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 王不留行对尿液细菌培养结果的影响 正常组中尿液细菌培养未见阳性结果，大鼠膀胱灌注大肠杆菌后第5天，模型组中尿液菌培养均为阳性，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），表明模型建立成功。王不留行醇沉组1.6 g/（kg·d）剂量给药4天后尿液细菌培养阳性率为40%，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。其余各组与模型组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 王不留行对膀胱组织病理表现的影响 正常大鼠的膀胱组织未见明显病变，采用大肠杆菌感染大鼠5 d后，模型组大鼠膀胱病变明显，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）;灌胃给药，治疗4 d后，王不留行醇沉部位各剂量组膀胱病变均明显减轻，与模型对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01或P<0.05），王不留行醇溶部位各剂量组膀胱病变无明显减轻，与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。在给药过程中，醇溶部位显示出一定毒性表现，1 600 mg/kg、800 mg/kg、200 mg/kg组各死亡小鼠4只、1只、2只。见图1，表2。

2.3 王不留行醇沉部位对膀胱组织IL-1β表达的影响 大肠杆菌感染SD大鼠后，膀胱组织的IL-1β mRNA以及蛋白明显高表达，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.001）。王不留行醇沉部位400 mg/kg剂量可明显抑制IL-1β mRNA以及蛋白的表达，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见图2、图3。

3 讨论

本文验证了王不留行对于大肠杆菌感染引起的UTIs具有明显的治疗效果，可以抑制细菌在尿液的增殖，并且抑制膀胱组织病理损伤。王不留行治疗UTIs的活性部位为其醇沉部位。查阅文献发现，王不留行醇沉部位的成分主要是多糖类化合物，王不留行多糖具有抗氧化和抑制良性前列腺增生的作用[5，8-9]。

作为抵御细菌感染的第一道细胞防线，泌尿道上皮表达多种模式识别受体，参与识别细菌感染的模式识别受体主要是Toll样受体[10]。Toll样受体识别大肠杆菌的脂多糖以及鞭毛蛋白后激活下游通路，从而导致NF-κB以及促炎因子如IL-1β、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）等基因的激活[11]。在UTIs患者的尿液及血清中同样可以检测到IL-1β，IL-6以及IL-8升高[12]。促炎因子一方面可以促进免疫细胞的趋化作用，另一方面会引起组织的炎性损伤[13]。本研究检测了IL-1β的变化，可见王不留行多糖可以有效抑制其在膀胱组织的表达，从而抑制膀胱组织损伤，这与膀胱组织病理染色结果一致。

多糖类成分通常不具有直接的杀菌和抑菌作用，但是仍能表现出有效的抗感染作用[14]。研究发现大多数多糖具有免疫调节的作用，也有研究发现多糖可以通过抑制细菌黏附从而抑制其感染[14-15]。王不留行多糖抑制UTIs可能的机制为抑制膀胱组织免疫反应，但是否具有其他作用机制还需要更进一步研究。总体来说，本研究发现王不留行多糖提取物为其治疗UTIs的有效部位，完善了王不留行治疗“淋证”中医理论的科学内涵，并为王不留行治疗UTIs的新药开发奠定了基础。

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（2019-05-21收稿 责任编辑：芮莉莉）