徐丽慧 裘春宁 董晓勤 金优萍 王贤军 吴盛海

HPV感染可引起皮肤或黏膜良性或恶性病变，约有5%的肿瘤与HPV感染有关[1]。HPV有200多种亚型，根据感染HPV后引起后果的严重程度分为高危型和低危型，低危型HPV与尖锐湿疣及呼吸道中的多发性乳头瘤相关，高危型HPV感染可导致癌变，包括宫颈及口咽部等的癌变[2]。宫颈癌是引起女性癌症死亡的第三大癌症[3]，如果在发病早期能够明确诊断，约90%的宫颈癌可以治愈。广泛开展HPV筛查及进行HPV多价疫苗注射是有效的预防手段[4]。我国不同地区女性人群受感染的HPV亚型分布不尽相同[5]。本研究以浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院2015—2020年妇科门诊患者与健康体检者为调查对象，了解HPV感染现状及变化趋势，以期为推广合适的HPV筛查策略和疫苗防治提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015—2020年在本院首次就诊的49 766例妇科门诊患者和12 342位女性健康体检者为研究对象，平均年龄分别为（38.50±11.33）岁和（43.25±11.23）岁，均行宫颈HPV筛查。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器和试剂 YN-H16恒温杂交仪，宫颈脱落细胞采集器及HPV基因分型（23型）检测试剂盒均由深圳亚能生物技术有限公司提供。

1.2.2 检测方法 采用PCR-反向斑点杂交法。（1）样本采集：采用窥阴器暴露宫颈口，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物拭去。取出宫颈刷置于宫颈口，单方向缓缓旋转4～5周以获得足量的上皮细胞；将刷头放入装有宫颈脱落细胞保存液的洗脱管中，立即送检。样本室温保存不超过12 h，4℃保存不超过7 d。（2）HPV DNA提取：充分洗脱宫颈刷并将洗脱液全部转移至1.5 ml离心管中，13 000 r/min 离心 10 min，弃上清液；加入 50 μl裂解液悬浮沉淀，沸水浴加热10 min；13 000 r/min离心 10 min，留取上清液备用。（3）PCR 扩增：20 μl反应液加5 μl已提取的待测样本DNA，按照下列条件进行扩增：50 ℃ 15 min；90 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s、42 ℃ 90 s、72℃ 30 s，40个循环；72℃ 延伸5min。（4）杂交及显色：15 ml离心管中加入标记编号的膜条，6 ml A液（0.03 mol/L柠檬酸钠）以及相应的PCR产物，沸水浴加热10 min，51℃杂交1.5 h，取出膜条，置于预热的B液（0.0075 mol/L柠檬酸钠）51℃洗涤5 min后，将膜条置于显色液中避光显色30 min。（5）结果判读：根据膜条上蓝色斑点显现的位置，读取相应位置上标注的基因型信息。仅1个基因型位点出现蓝色斑点，则为相应基因型的单一感染；多个基因型位点出现蓝色斑点，则为相应基因型的混合感染。共检测23种HPV基因型，根据致病性不同分为：高危型共17种，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82；低危型共 6 种，包括 HPV 6、11、42、43、81 和 83。（6）质量控制：阴性质控品的杂交膜条除IC位点有蓝色斑点外均不显色，阳性质控品必须在相应的HPV基因型位点及IC位点显色，否则试验失败。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妇科门诊患者与健康体检者HPV感染率比较及年度变化 妇科门诊患者HPV感染率高于健康体检者（P＜0.05）。无论是妇科门诊患者还是健康体检者，HPV感染率 2018—2020年较 2015—2017年下降（P＜0.05）。妇科门诊患者HPV多重感染率也高于健康体检者（P＜0.05），健康体检者的HPV多重感染率2018—2020年较 2015—2017年下降（P＜0.05），但妇科门诊患者HPV多重感染率2018—2020年与2015—2017年比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 妇科门诊患者与健康体检者感染HPV亚型分布情况及年度变化 无论是妇科门诊患者还是健康体检者，单一HPV感染中，52亚型占比最高，分别为18.69%和18.62%。妇科门诊患者单一亚型感染占比较高的还有16亚型（10.59%），58亚型（8.46%），53亚型（7.05%），81亚型（6.82%）。健康体检者单一亚型感染占比较高的还有81亚型（10.22%），53亚型（9.35%），58亚型（9.03%），16亚型（7.37%）。其中妇科门诊患者16亚型及健康体检者51亚型占比2018—2020年较2015—2017年明显降低（P＜0.05）。2种亚型感染中，妇科门诊患者以16亚型和52亚型混合感染为主（2.80%），健康体检者以52亚型和81亚型混合感染为主（4.55%）。除了健康体检者33亚型和58亚型混合感染2018—2020年（P＜0.05）外，其余两组人群的多重感染年度变化无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

2.3 不同年龄段妇科门诊患者与健康体检者HPV高危亚型感染情况 妇科门诊患者中，HPV高危亚型感染率的年龄分布变化呈现两个峰谷，两个峰值年龄分别为＜20岁（44.28%）和60～岁（31.35%）。对应的谷值年龄分别为30～岁（17.75%）和＞70岁（20.00%）。且妇科门诊30～岁、40～岁和50～岁患者2018—2020年HPV高危亚型感染率较2015—2017年明显下降（P＜0.05）。同样，健康体检者HPV高危亚型感染率的年龄分布也同样为两个峰谷，其中60～岁者HPV高危亚型感染阳性率最高（14.92%），＞70岁者最低者（3.01%）；20～岁、30～岁和40～岁者HPV高危亚型感染率2018—2020年较2015—2017 年明显下降（均 P＜0.05），而 50～岁、60～岁和＞70岁者HPV高危亚型感染率年度变化无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

3 讨论

HPV高危亚型持续性感染是宫颈癌的主要致病因素之一，HPV检测及疫苗注射是有效的早期预防宫颈癌手段[4]。本研究回顾分析了2015—2020年本院妇科门诊患者和健康体检者HPV感染情况，妇科门诊患者HPV感染阳性率为23.97%，其中约1/4患者为多重HPV亚型感染。虽然健康体检者HPV感染阳性率低于妇科门诊患者，但也达到了13.23%。相似的约1/4患者为多重HPV亚型感染。本研究结果表明，杭州地区妇科门诊患者HPV感染阳性率要高于北京地区（2015—2016年）的 19.0%[6]和深圳地区（2014—2016年）的11.02%[5]。HPV感染阳性率高低主要与初次性生活的年龄、性行为习惯、性伴侣数、吸烟、长期口服避孕药及免疫缺陷与抑制等有关[7]。本研究回顾分析的妇科门诊患者中，相对于其他年龄段患者，＜20岁的人群高危亚型HPV感染率最高，值得引起社会和医生关注。

表1 2015—2020年妇科门诊患者与健康体检者的HPV感染情况[例（%）]

表2 2015—2020年妇科门诊患者与健康体检者感染HPV亚型分布情况

表3 不同年龄段妇科门诊患者与健康体检者HPV高危亚型感染情况（%）

无论是妇科门诊患者还是健康体检者，＜20岁和60～岁年龄人群高危亚型HPV感染率高于平均水平，而30～岁和40～岁人群高危亚型HPV感染阳性率低于平均水平，与文献报道有一定差异[8]。由于不同年龄段人群的性生活活跃度、宫颈局部免疫易感或免疫自我清除状态不同，HPV感染阳性率亦不同。＜20岁的人群由于生活工作尚不稳定，且性生活不规律，可能出现感染的高峰，而对于绝经后女性，由于生殖道局部免疫力下降，影响了免疫清除病毒能力，导致高危亚型HPV感染阳性率随着年龄的增大而逐渐上升，本研究也发现妇科门诊患者中60岁以上人群的HPV高危亚型感染率以及健康体检者50岁以上人群的HPV高危亚型感染率在2015—2020年的前3年和后3年的波动无统计学差异，提示了50岁以上人群存在持续HPV高危亚型感染。持续高危亚型HPV感染是宫颈癌前病变和宫颈浸润癌发生的必要条件[9]，因此不可忽视对绝经后女性早期宫颈癌的筛查。加拿大的研究数据表明宫颈癌筛查应一直持续到75岁才可能降低宫颈癌发生风险[10]。

对HPV感染亚型的分析发现，妇科门诊患者和健康体检者感染高危型HPV亚型为52、16、58、53和51，低危HPV亚型主要是81。有研究表明HPV高危亚型感染是引起宫颈癌及宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的主要病因[11]。但相关研究提示，除HPV 16型外，中国等亚洲国家中与宫颈病变相关性较高、致病性较高的HPV亚型可能与其他国家有所不同，具有一定的特殊性[6]。国内有研究对267例CINⅡ+患者进行HPV分型检测后发现，与CINⅡ+最相关的亚型是HPV 16、52和58型[12]，本研究数据显示这3种亚型感染在门诊患者中为前3名HPV亚型，且无论是妇科门诊患者还是健康体检者，单一HPV感染52亚型占比均高于18%。且2种亚型感染中，妇科门诊患者以16亚型和52亚型混合感染为主，占比达到2.80%。需要引起重视的是，目前国内的预防性HPV疫苗二价、四价分别覆盖 16、18型和 6、11、16、18型，而不能完全覆盖国内调查数据显示优势高危亚型：52、58、53和51型，而九价疫苗在四价基础上增加31、33、45、52和58型，对于国人会是更好的选择。本研究结果与深圳地区的数据相似，而与其他地区有所差别[5]。

综上所述，杭州地区妇科门诊患者和健康体检者HPV 感染以高危亚型 52、16、58、53、51 及低危亚型 81型为主，且多重感染以高危型52型为主，目前九价疫苗能更好覆盖杭州地区人群常见的HPV亚型。妇科门诊患者和健康体检者HPV高危亚型感染率均呈现随年龄呈现先下降再上升再下降的变化，且门诊患者中＜20岁的患者及60岁以上患者和健康体检者中50～70岁人群具有持续高水平的HPV高危亚型感染率，应引起更多关注。