刘 悦，曲 浩，尚卫琼，孙云南，田易萍，仝佳音，陈林波

（云南省农业科学院茶叶研究所，云南省茶学重点实验室，云南勐海666201）

茶树在叶片颜色上具有很大的多样性，不同程度积累花青素[1]。紫娟茶树（Camellia sinensis cv.Zijuan）的特色之一就是叶片在不同发育阶段的颜色由紫色变为绿色，一部分因素是因为花青素等内含物质发生变化。目前，消费者对食品质量具有较高的要求，茶叶中的花青素含量对消费者的选择有着较强的影响。有研究显示[2]，调控因子决定结构基因表达与否及强弱，影响花青素合成水平。目前，对拟南芥、玉米、牵牛花等模式植物和农作物在黄酮类化合物的生物合成方面有着广泛的研究，并已发现一些转录因子对花青素生物合成途径的基因具有调节作用[3]。MicroRNAs（miRNAs）作为一种重要的内源性非编码小RNA，在植物基因表达过程中起着关键的调控作用[4]。miR828a 的靶基因WER 是最大的转录因子家族MYB 的成员之一，MYB 家族在植物发育、代谢、生物和非生物胁迫的反应中起着关键的调节作用，但茶树中有关miRNAs 及靶基因的作用目前报道还较少。

miRNAs 最重要的功能是能够启动具有多个mRNA 靶标的调控级联反应，在转录水平发挥作用，通过RNA 切割或翻译抑制目标基因的表达[5]。有研究表明，植物组织的花青素含量受miRNAs 的影响[6]，例如，拟南芥中miR828 的过表达导致MYB转录因子的表达水平降低，从而降低花青素水平[7]；在番茄中，miR828 被认为是花青素生物合成的负调控因子，调控MYB 转录因子的表达[8-9]；在苹果中，miR828 可靶向 19 个 MYB 转录因子，这些MYB 基因大部分都参与调控花青素合成相关的初级和次级代谢[10]；在荔枝中，miR156a 在果实成熟过程中产生差异表达，并通过SPL1 的调控影响花青素的积累[11]。miR828 是近年来通过深度测序发现的一种新的miRNA， 而茶树miR828 靶基因功能研究还不太详尽。

本研究在前期对不同叶色茶树 （紫娟为紫色、云抗10 号为黄绿色、 福鼎大白茶为绿色） 进行miRNA 测序分析时， 在紫娟茶树叶片中发现了一条miR828a 片段具有显著差异， 该片段与拟南芥miR828a 高度同源；通过对miR828a 的靶基因预测发现 12 个靶基因， 其中包含 MYB 家族基因WER。 本研究对WER 基因进行克隆，获得了一条长度为885 bp 的WER 序列， 通过生物信息学软件构建了WER 的系统发育树，并对其疏水性、结构域、 三维结构等进行预测， 旨在为进一步研究miR828a 及靶基因WER 在紫娟茶树花青素合成中的功能机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用云南省农业科学院茶叶研究所试验基地的紫娟茶树一芽二叶为材料；样品采集后液氮速冻保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 的合成 样品经液氮研磨后， 总RNA 的提取选用通用型超纯RNA 提取试剂盒（GR2011）；用于基因验证的cDNA 采用第1链 cDNA 合成试剂盒（Thermo k1621）。

1.2.2 WER 基因的克隆 根据获得的miR828a 靶基因 WER 片段序列信息， 利用Primer 5.0 软 件 设 计 3′ RACE 接 头 引 物3RACEP1 和 3RACEP2，5′ RACE 接 头 引 物5RACEP1 和 5RACEP2，3′端特异引物 3′-inner 和 3′-outer，5′端特异引物 5′-inner 和5′-outer（表 1）。 用 RACE 方法对 WER 基因片段3′端和5′端进行克隆， 拼接验证后获得全长cD-NA，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序。

表1 引物序列

1.2.3 WER 基因的生物信息学分析 生物信息学分析参照文献[12-13]进行，在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 上完成核苷酸和蛋白序列比对分析；利用Protparam 工具进行基因编码蛋白理化性质分析； 采用SignalP 预测氨基酸序列信号肽； 采用ProtScale 进行亲水性分析；采用ProtCompv. 9.0 进行亚细胞定位分析；并采用MEGA 7.0 软件进行WER 及相关蛋白进化树的构建；利用SWISS-MoDEL 预测蛋白质三维结构。

以紫娟茶树叶片的基因组DNA 为模板，利用引物进行 PCR 扩增，5′RACE 和 3′RACE 分别扩增得到643、282 bp 的片段，拼接后得到一条长度为885 bp 的序列，其中，A 碱基 263 个，占 29.72%；G碱基 203 个，占 22.94%；C 碱基 175 个，占 19.77%；T 碱基 244 个，占 27.57%，分子量为 272 911（图 1）。有55 个常见酶切位点，其中包含一条长度为276 bp的完整开放阅读框，编码92 个氨基酸。蛋白质理论分子质量为10.7 ku，理论等电点为10.92。正电荷残基总数（Arg＋Lys）为12 个，负电荷残基总数（Asp＋Glu）为 6 个。分子式为 C495H790N134O128S1。估计半衰期为20 h，不稳定指数64.31（不稳定蛋白质），脂溶系数111.2，亲水性平均值-0.034。

2.2 WER 系统进化分析

为了解茶树WER 蛋白的系统进化，将拼接得到的WER 序列通过MEGA 6.0 进行多重序列比对分析，并构建系统发育树，结果表明，19 种植物分为2 个大的分支，茶树WER 与麻风树JcMYB114、蒲桃 SoMYB114、桃树 PoMYB7、碧桃 PpWER、青梅PmTT2、樱桃 PaMYB114、白梨 LOC103958466、苹果MdMYB5、锦葵 HuMYB114、可可 LOC1860-6229、核桃JrMYB114、白栎QiMYB114、栓皮槠QsMYB-114 归为同一个分支，其中，茶树WER 与蒲桃SoMYB114 亲缘关系较近（图 2）。

2.3 WER 蛋白疏水性分析

通过推测的氨基酸序列利用ProtScale 工具进行蛋白一级结构的亲/疏水性预测，使用默认的Hphob./Kyte&Doolittle 标度打分。平均疏水性系数为-0.034，从亲水性分析可得，WER 属于不稳定亲水蛋白（负值为亲水，正值为疏水）。其中，最高正值1.844出现在第40 位氨基酸，疏水性最强；最小负值-1.822 出现在第81 位氨基酸，亲水性最强（图3-A）。信号肽预测结果显示（图3-B），信号肽预测值为0.287 5，其他预测值为0.712 5。因此，MYC1 蛋白不含有信号肽，没有信号识别功能，为非分泌蛋白。

2.4 WER 蛋白跨膜区预测

通过SMART 程序预测发现，WER 氨基酸序列上有一个跨膜螺旋区域（图4-A）；利用TMHMMv2.0在线工具进行预测分析，得到WER 第25—47 位氨基酸为跨膜螺旋区，第1—24 位氨基酸在膜内侧，第48—92 位氨基酸在膜外侧（图4-B）。

2.5 WER 蛋白亚细胞定位预测

通过ProtComp v9.0 在线工具对WER 的亚细胞定位进行预测分析可知，WER 可能定位在质膜和线粒体上，综合得分分别为3.22、3.59 分（表2）。

表2 WER 亚细胞定位预测 分

2.6 WER 蛋白三维结构预测

使用SWISS-MODEL 在线工具构建紫娟茶树WER 蛋白的三维结构模型（图 5-A），WER 蛋白三维结构与模板结构相似度为25%。图5-B 中，深色区域为完全允许区域，散点大多集中在深色区域，表明WER 蛋白三维结构预测结果较为可靠。

3 结论与讨论

许多富含次生代谢物的植物中，MYB 基因的表达量较高，同时也有大量的miRNA 表达；并且许多以MYB 为靶点的miRNA 都与其靶点非常接近，这种相关性可能是共同进化的结果[14]。在进化过程中，部分植物会产生特有的颜色，研究表明，含有丰富花青素的植物具有更多的MYB 基因[10]。紫娟茶树的嫩叶为紫色，其花青素含量比绿色叶片高。研究miR828a 靶基因WER 能够为紫娟茶树叶片颜色变化提供理论基础。另外，WER、GL1 和MYB23 基因密切相关，在拟南芥中参与调控植物表皮细胞[15]，并且WER 基因对根毛细胞分化有着促进作用[16]。有报道显示[17]，WER 和GL1 基因在功能上是相同的，其顺式调控序列的变化完全是由于这2 个基因功能存在差异。

本研究在紫娟茶树中克隆得到WER 基因，长度为885 bp，包含一条长度为276 bp 的完整开放阅读框，编码92 个氨基酸；预测其编码的蛋白属于非分泌蛋白，信号肽分析则说明其不具有信号识别功能。另外，WER 预测蛋白序列含有1 个跨膜螺旋结构域，这个功能域或许决定了WER 在紫娟茶树中的功能。一般来说，跨膜结构域发挥着信息传递的作用，对细胞内的激活机制具有重要贡献[18]。通过蛋白亚细胞定位预测，发现WER 大概率分布于质膜和线粒体上。因此，推测紫娟茶树WER 蛋白在质膜与线粒体上通过跨膜结构域在细胞内发挥着信号转导作用。本研究结果将为进一步探明miR828a 靶基因WER 在花青素合成方面的作用提供理论基础。