李文杰,王晨晨,颜朦朦,李慧冬,丁蕊艳,方丽萍,王兰芝,侯运华,杨亲正,*,陈子雷,4,*(.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院,生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,山东济南 250353;2.山东省农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,山东济南 25000;3.山东省食品质量安全检测技术重点实验室,山东济南 25000;4.山东师范大学生命科学学院,山东济南 25004)

沙丁胺醇(SAL)为瘦肉精的一种,添加微量沙丁胺醇于牲畜饲料内,可以增加牲畜的瘦肉量、减少脂肪。然而其残留会导致人体产生肌肉震颤、头痛、心悸等不良症状,因此在欧盟及中国的动物饲料中已被禁用[1-6]。现有测定SAL的方法很多,如酶联免疫吸附实验(ELISA)[7-9]、气相色谱-质谱法(GC/MS)[10-11]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[12-14]和串联质谱法(MS/MS)等[15-16]。然而这些方法大都需要昂贵的设备、熟练的技术人员和长时间的检测分析。因此,开发简单方便、快速灵敏、成本低廉、特异性高的分析方法已成为当前的迫切需要。

表面等离子体共振技术(SPR)最初主要通过光学上的折射率变化应用于监测大分子间的相互作用,如考察抗原-抗体、受体-配体、适配体-识别物之间的亲和力,随后广泛应用到小分子检测领域,其具有快速、无标记、灵敏度高的优点。SPR免疫传感器应用较为常见,其检测方法主要为抑制法[17-21]。定量的抗体与芯片表面的抗原结合时在SPR传感器上产生一个响应值。将这一定量的抗体与待测物混合,待测物会消耗掉一定的抗体。当混合物再与芯片表面作用时,通过计算SPR传感器降低的响应数值可以测算待测物的浓度。SPR免疫传感器研制中,抗原/抗体在SPR芯片上的固定是非常关键的一步。硫醇分子是一种包含巯基和羧基的双功能分子,通过巯基与金形成Au-S键,在金膜表面形成单分子层,有效减少蛋白质在金片上的非特异性吸附。同时,羧基通过碳二亚胺法与抗原/抗体中的氨基共价偶联,从而将抗原/抗体结合在具有基底金膜的芯片表面。作为连接分子,硫醇中羧基基团的密度极大的影响着抗原/抗体结合,进而影响传感器灵敏度和检测性能。近年来,研究人员通过引入了混合硫醇单分子层SAMs来调节表面羧基官能团的浓度,来解决抗原/抗体结合中的空间位阻问题。Gobi等[22]通过不含羧基(1-癸硫醇)和含有羧基(11-巯基十一烷酸)相混合的模式来改变空间环境。Tsai等[23]也提出混合连接体这一策略,通过变换化合物的链长(己硫醇和16-巯基十六烷基酸),以期达到良好的空间微环境。然而,这些混合模式虽然降低羧基密度,但有效的硫醇连接分子无法均匀分布,仍会导致抗原/抗体聚集不均匀,从而影响测试的灵敏度。

基于以上科学问题,本文提出用双巯基双羧酸的DMSA来代替传统的连接分子如单巯基单羧酸的MPA,以降低空间位阻及控制抗体的构型和取向。通过SEM、AFM、电化学等表征手段考察通过不同硫醇单分子连接抗原修饰后的SPR芯片的形貌,并通过考察连接抗原后的SPR芯片与抗体间的识别效率确定SPR免疫传感器的检测性能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPR裸芯片 北京中龙益诚科技公司;巯基丙酸(MPA)、二巯基丁二酸(DMSA) Sigma-Aldrich;沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、盐酸马布特罗、西马特罗 BePure;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)羰基二酰亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 生工生物工程(上海)公司;乙醇胺盐酸盐 阿拉丁;K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]·3H2O、KNO3、KCl、三水合乙酸钠 国药集团化学试剂有限公司;沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶联物(SAL-BSA)、SAL单克隆抗体(SAL-Ab) 深圳宝安康生物技术有限公司;猪肉 济南华联超市。

YC-SPR-A1表面等离子体共振仪 北京中龙益诚科技公司;CHI 760E电化学工作站 上海辰华仪器有限公司;Cary 5000紫外-可见分光光度计 安捷伦;JSM-6700冷场发射扫描电子显微镜 日本电子;Nano Scope-IIIa原子力显微镜 美国DI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 传感器芯片修饰及检测原理 传感器芯片修饰过程如图1a所示,以MPA和DMSA作为自组装单分子层分别通过碳二亚胺法将沙丁胺醇-牛血清白蛋白偶联物(salbutamol hydrochloridbovine serum albumin conjugate,SAL-BSA)固定在SPR裸芯片表面。抑制法检测沙丁胺醇的原理如图1b所示,首先将待测物与抗体混合,当无沙丁胺醇时,抗体与芯片表面的抗原结合数量多,SPR的折射率强。当存在沙丁胺醇时,沙丁胺醇会消耗掉其中的部分抗体,SPR的折射率减小。SPR 的折射率随着沙丁胺醇浓度的不同而不同。

图1 原理图Fig.1 Schematic diagram注:a:以DMSA和MPA为SAMs的沙丁胺醇免疫传感器芯片的修饰过程;b:抑制法测试沙丁胺醇。

1.2.2 不同连接单分子对SPR裸芯片的修饰 将SPR裸芯片分别置于0.5 mmol/L MPA和DMSA溶液中,反应24 h。反应结束后,用乙醇和去离子水冲洗SPR芯片,并用氮气干燥。

1.2.3 沙丁胺醇抗原的组装 将1.2.2所制备SPR芯片置于400 mmol/L EDC和100 mmol/L NHS的溶液中,室温下反应30 min。反应结束后,用去离子水冲洗SPR芯片,并用氮气干燥。

用200 μL SAL-BSA溶液(1 mg/mL)涂覆上述处理的SPR芯片,并用乙醇胺溶液(1.0 mol/L,pH8.5)封闭未反应的活性位点,最后用PBS溶液冲洗,得到MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA SPR芯片,在4 ℃下密封保存。

1.2.4 SAL-BSA修饰的SPR芯片活性考察 将不同浓度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)的SAL-Ab PBS溶液分别泵入SPR反应池中与MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA的SPR芯片反应,流速为100 μL/min,再生溶液为100 mmol/L NaOH,再生液流速为400 μL/min,再生时间为30 s,并记录表面等离子体共振仪的响应值变化。

1.2.5 SAL-BSA修饰的SPR芯片表征

1.2.5.1 电化学表征 SPR芯片为工作电极,铂(Pt)为对电极,Ag/AgCl为参比电极,在0.5～1 V电压范围内扫描20圈,扫描速率为100 mVs-1。以铁氰化钾溶液(5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-,0.1 mol/L KCl和0.1 mol/L KNO3)为探针溶液,通过循环伏安曲线(CV)表征MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA芯片的电化学行为。

1.2.5.2 表面形貌表征 用SEM和AFM对MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA SPR芯片的表面形貌进行表征。SEM仪器参数:二次电子像分辨率:1.0 nm(15 kV),2.2 nm(1 kV);背散射电子像分辨率:3 nm(15 kV,WD=8 mm);放大倍数:50000;加速电压:15 kV;电子束流:10-13～2×10-9A;数字图像采集系统分辨率:1280×1024。AFM仪器参数:空间分辨率:XY:0.2 nm,Z:0.1 nm;扫描分辨率:1024×1024 pixels;光谱分辨率:1 cm-1;纳米化学像空间分辨率10 nm;激光波段:950～1900 cm-1,2700～4000 cm-1。

1.3 沙丁胺醇的测定

1.3.1 沙丁胺醇抗体浓度的选择 将浓度为25 μg/mL的SAL-Ab和不同浓度的SAL标准溶液(5、10、20、30、40、60、80、100、150 ng/mL)等体积混合,在37℃条件下温育30 min,每个浓度重复测定3次,记录SPR仪的响应值变化。

1.3.2 实际样品添加回收 本实验所用猪肉用UPLC-MS/MS检测无沙丁胺醇。将不同浓度(5,10,20 ng/mL)的沙丁胺醇标准溶液加入到1 g猪肉空白样品中,静置1 h,然后加入10 mL乙腈,均质提取1 min,取1 mL上清液于5 mL离心管中,氮气吹干,再用2 mL正己烷溶解,然后加入1 mL PBS溶液,充分振荡均匀,并在85 ℃的水浴中温育3 min,收集底部液体作为测试液体,待测液体通过0.22 μm滤膜过滤,取250 μL用于SPR免疫传感器检测,并重复制备每种浓度,每种添加浓度水平重复3次。

1.3.3 样品的UPLC-MS/MS检测 取1 mL 1.3.2制备的提取液于5 mL离心管中,氮气吹干,再用2 mL正己烷溶解,然后加入1 mL甲醇溶液,充分振荡均匀,取甲醇部分溶液上机检测,并通过0.22 μm滤膜过滤,每种添加浓度水平重复3次。

1.3.4 UPLC-MS/MS检测条件 色谱柱:EclipsePlus C18 RRHD(100×2.1 mm,1.8 μm,Agilent);柱温:30 ℃;流动相条件:流动相A和流动相B分别为乙腈和0.1%甲酸-水溶液,比例为75∶25;洗脱程序:等度洗脱;流速:300 μL/min;进样量:5 μL。离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子扫描,多反应监测模式(MRM);干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:6 L/min;雾化器压力:35 psi;毛细管电压:4000 V;喷嘴压力:500 V;去簇电压:28 V;母离子(m/z):240.0;子离子(m/z):148.0*/222.0(*为定量离子);裂解电压(V):100/100;碰撞能量(V):15/5。

1.4 数据处理

以无待测SAL分子抑制的响应值为B0,一定浓度的待测SAL分子抑制时的响应值为B值,可计算抑制率:抑制率(%)=[(B0-B)/B0]×100,以SAL分子浓度C的对数log C为横坐标,以抑制率为纵坐标,用软件进行曲线拟合绘制标准曲线,每个样品三次重复(n=3)。

2 结果与分析

2.1 SAL-BSA修饰的SPR芯片活性考察

为了研究MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA SPR芯片上抗原/抗体结合的结合效率,以相同浓度的SAL-Ab流经SPR芯片表面产生的SPR信号响应值的变化作为判断标准。在SAL-Ab的浓度相同时,芯片的折射率差值即SPR信号响应值(ΔRU)越高说明芯片上SAL-Ab结合的数量越多。图2为MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA芯片在相同SAL-Ab浓度下的SPR信号响应情况,由图2可知,当SAL-Ab浓度同为75 μg/mL时,两芯片可结合的SAL-Ab的浓度已经饱和,此时MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA SPR芯片的折射率差值为58.8和115.6,这表明DMSA芯片在相同的实验条件下可以结合更多的SAL-Ab。

图2 在不同SAL-Ab浓度下芯片折射率变化 Fig.2 SPR index change of chip at different SAL-Ab concentrations注:a:MPA-SAL-BSA芯片SPR折射率变化情况;b:DMSA-SAL-BSA芯片的SPR折射率变化情况。

2.2 SAL-BSA修饰的SPR芯片表征

2.2.1 表面形貌表征 通过SEM和AFM对MPA-SAL-BSA和DMSA-SAL-BSA芯片进行了形貌表征。SEM结果(图3a～图3c)表明,DMSA-SAL-BSA芯片的表面均匀程度优于MPA-SAL-BSA芯片,这一结果进一步由AFM表征图证明,如图3d～图3f所示,裸芯片(图3d)的表面粗糙度Rq和Ra值分别为0.836、0.684 nm,MPA-SAL-BSA芯片(图3e)的表面粗糙度Rq和Ra值分别为2.09、1.66 nm,而DMSA-SAL-BSA芯片(图3f)的表面粗糙度Rq和Ra值分别为1.86、1.49 nm。因此,DMSA-SAL-BSA的芯片表面比MPA-SAL-BSA的更平整、更均匀。结合活性考察实验结果,推测MPA芯片性能不佳是由于芯片上的SAL-BSA分布不均匀,与SAL-Ab结合的活性位点相互阻隔,从而导致SAL-BSA和SAL-Ab结合减少。因此,DMSA能够改善抗原之间的空间微环境,进而提高抗原-抗体之间结合效率。

图3 SPR芯片形貌图Fig.3 SPR chip shape diagram注:a～c分别为裸芯片、MPA-SAL-BSA芯片、DMSA-SAL-BSA芯片的SEM图;d～f分别为裸芯片、MPA-SAL-BSA芯片、DMSA-SAL-BSA芯片的AFM图;SEM图放大倍数50000×;AFM图尺寸大小1×1 μm。

2.2.2 电化学表征 采用循环伏安法在铁氰化钾溶液中比较了不同SPR芯片的循环伏安特征。如图4所示,MPA-SAL-BSA芯片和DMSA-SAL-BSA芯片的氧化还原峰均小于裸芯片的氧化还原峰,表明SAL-BSA均修饰到芯片上,而MPA-SAL-BSA芯片的氧化还原峰大于DMSA-SAL-BSA芯片的氧化还原峰,说明MPA-SAL-BSA芯片表面的SAL-BSA不均匀,存在较大的间隙,提供了电子通道允许铁氰化钾离子通过溶液接触到芯片表面,提高了氧化还原峰的响应值,结合AFM结果,进一步说明DMSA-SAL-BSA芯片上的SAL-BSA均匀程度更高,充分利用了芯片表面的空间,阻碍了铁氰化钾离子与芯片表面接触。因此,DMSA作为连接分子效果优于传统的MPA连接分子。

图4 SPR芯片的CV图Fig.4 CV of SPR chip 注:a:裸芯片CV图;b:MPA-SAL-BSA芯片CV图;c:DMSA-SAL-BSA芯片CV图。

2.3 沙丁胺醇测定

2.3.1 最佳抗体浓度的选择 在优化的实验条件下,考察了DMSA-SAL-BSA芯片检测沙丁胺醇实验中SAL-Ab的最佳浓度。从图5可以看出,当SAL浓度增大的情况下,SAL对SAL-Ab抑制率均增大。其中图5a的线性方程为:y=-0.0086x2+1.7883x+18.524(R2=0.912),图5b的线性方程为:y=-0.0054x2+1.471x-1.7194(R2=0.987),图5c的线性方程为y=0.0006x2+0.1862x+2.5692(R2=0.961)抗体浓度为25 μg/mL时,检测灵敏度最好。考虑到实验成本和检测灵敏度,将SAL-Ab浓度25 μg/mL作为反应浓度。数据点的相对标准偏差(RSD)在4%以内,并在图中显示为误差线(图5b)。

图5 三个不同SAL-Ab浓度在相同SPR条件下检测SAL的抑制率变化与SAL浓度的关系Fig.5 Relationship between the change of inhibition rate of SAL and the concentration of SAL detected by three different SAL-Ab concentrations under the same SPR condition注:a:12.5 μg/mL;b:25 μg/mL;c:50 μg/mL。

2.3.2 标准曲线绘制 在上述最佳条件下,将基于DMSA为连接体的SPR免疫传感器应用于SAL的检测。如图6所示以SAL分子浓度C的对数为横坐标,以抑制率为纵坐标,用软件进行曲线拟合绘制标准曲线,获得回归方程y=0.008x2-1.95x+114.29(R2=0.982),将传感器检测沙丁胺醇能被测定的最低量作为LOQ,为5 ng/mL,IC50为39.1 ng/mL。

图6 SPR免疫传感器检测SAL的标准曲线Fig.6 Standard curve for SAL detection by SPR immunosensor

2.3.3 猪肉样品中SAL的检测 为了验证SPR方法的准确性和可靠性,将猪肉用作样品基质,添加浓度为5、10和20 μg/kg时的添加回收实验(n=3),结果如表1所示,本文方法检测SAL的回收率为94.9%～108.0%,RSD为1.30%～5.58%,与UPLC-MS/MS方法的结果相比,具有良好的一致性。因此,本文建立的方法适用于猪肉样品中SAL的定量分析。

表1 猪肉样品中沙丁胺醇的DMSA-SPR免疫传感器和UPLC/MS/MS测定结果(n=3)Table 1 Results of salbutamol in pork samples by DMSA-SPR immunosensor and UPLC/MS/MS (n=3)

为了考察本文方法的识别特异性,选取了相同浓度(120 ng/mL)的莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、盐酸马布特罗和西马特罗为SAL的结构类似物。如图7所示,SAL的抑制率明显高于其他化合物,而且与混合物(120 ng/mL)的抑制率相差不大。因此,本文方法具有很好的特异识别性能。

图7 DMSA-SPR免疫传感器特异性分析Fig.7 Specific analysis of DMSA-SPR immunosensor

同时将所提出的竞争性DMSA-SPR免疫传感器方法与先前报道的用于检测沙丁胺醇的方法相比较,如表2所示,SPR传感器的方法的检测范围与最低检测值都低于表中所列方法,表明竞争性DMSA-SPR免疫传感器方法是一种灵敏的方法,可用于食品中沙丁胺醇的检测。

表2 沙丁胺醇检测方法之间的比较Table 2 Comparison between salbutamol detection methods

3 结论

本实验首次比较了DMSA和MPA作为SAMs的表面羧基官能团的浓度和排布,从实验结果分析,具有双巯基、双羧酸特殊结构的DMSA相较于单巯基、单羧酸的MPA传统连接分子构建的SPR芯片,SPR传感器灵敏度更高。验证了硫醇中羧基基团的密度和分布会影响SPR芯片表面抗原/抗体的结合。本文提出的通过使用DMSA作为SAMs来提高SPR免疫传感器的检测效率是一种有效的新思路,可应用于其他小分子的方便快捷、高灵敏检测。