徐菲菲,许 健,陈 驰,刘 飞,钟 芳,陈茂深,李 玥(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

肠衣膜分为三类:纤维素肠衣膜；猪、牛、羊来源的天然肠衣膜；真皮层来源的胶原蛋白肠衣膜[1]。但纤维素肠衣不可食用,天然肠衣产量小、成本高、产品稳定性差,而且国内产出的天然肠衣主要是出口至美、日、欧洲等地[2]。这给胶原蛋白肠衣的蓬勃发展提供了基础。

天然纤维素是自然界广泛存在的重要的可再生资源[3-5],因其安全、无毒以及环境友好性而被应用在工业的许多领域中。软木纤维素作为天然纤维素的一种,从木材(软木)中提取,目前被广泛应用在胶原蛋白肠衣中,用于增加其力学性能,使之更好的应用在实际中。陈志强[6]于1995年申请了碱性胶原蛋白肠衣、粘合胶原蛋白肠衣、酸性胶原蛋白肠衣的发明专利。同期黄炳华等[7]也申请了相关的发明专利,研究主要集中在牛二层皮经酸、碱溶胀粉碎后的成膜性能,但深度不够。叶勇[8]通过添加羧甲基纤维素钠(CMC)、改性玉米淀粉、聚乙二醇等添加剂对胶原蛋白肠衣进行改性,并用戊二醛进行交联来提高胶原蛋白肠衣的机械性能。秦溪[9]以鱼皮胶原为基质制备胶原蛋白肠衣,是国内第一例以非哺乳动物胶原为原料制备的胶原蛋白肠衣。潘鹏[10]采用天然肠衣的残次品回收再利用制备胶原蛋白肠衣膜,并对其进行改性。Wang等[11]研究通过物理交联的方式替代传统的化学交联,降低胶原蛋白肠衣潜在毒性。

国外胶原蛋白肠衣起步于上个世纪30年代,但报道有限,主要以专利形式报告。Morgan等[12]在澳大利亚、中国、西班牙等地发表多篇同名专利。国外胶原蛋白肠衣的核心技术掌握在少数几个企业手中,如英国Devro、日本Nippi及德国Naturin,这增加了胶原蛋白肠衣行业的技术壁垒,学者的研究主要集中在胶团复配及胶团酸胀工艺对胶原蛋白肠衣性能的影响。

本文以胶原肠衣生产中广泛采用的软木纤维素为代表,从机械性能、收缩率及透明度等方面,研究纤维素的添加量对肠衣膜性能的影响;而后通过添加不同种类的亲水胶体(软木纤维素、微晶纤维素、竹纤维素、魔芋胶、瓜尔胶、羟丙基甲基纤维素(Hydroxypropyl methylcellulose,HPMC)和海藻酸丙二醇酯(Propylene glycol alginate,PGA)),考察其对胶原肠衣膜性能的影响,以期解决胶原蛋白肠衣工业生产中的实际问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛二层皮 北京秋实农业股份有限公司提供;甘油、浓盐酸、硫酸铵、柠檬酸、柠檬酸钠 国药集团化学试剂有限公司;软木纤维素、竹纤维素 美国FMC公司;微晶纤维素 上海昌为医药辅料公司;瓜尔胶、魔芋胶 上海恒生化工公司;羟丙基甲基纤维素 美国Sigma公司;海藻酸丙二醇酯 山东洁晶集团;所用添加剂 均为食品级。

Panda Plus高压均质机 德国GEA公司;Fisco-1S真空搅拌脱气机 德国Fluko公司;Discovery DHR-3旋转流变仪 美国TA公司;物性分析仪 英国SMS公司;OCA15EC视频光学接触角测量仪 德国德菲仪器有限公司;Nicolet iS50 FTIR傅里叶红外光谱仪 美国赛默飞世尔公司;UltraScan Pro1166高精度分光测色仪 美国Hunterlab公司;204 F1差式扫描量热仪 德国耐驰仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛二层皮洗涤 根据北京秋实农业股份有限公司生产工艺,在研究中进行适当调整。用牛二层皮3倍重的清水洗涤牛皮多次,每次2 h,脱去表面灰分,直至水洗液电导率小于4500 μm/s。加入3%的硫酸铵(g/牛皮干基重)水洗牛皮脱除钙离子,洗涤3 h。加入牛皮重1%柠檬酸三钠、慢慢加入约1%柠檬酸,将牛二层皮pH调节到4.6,洗涤8 h。再用去离子水洗涤牛皮直至水洗液电导率<500 μm/s时,牛二层皮洗涤完毕。

1.2.2 胶原团制备 将洗净牛皮剪成1 cm×1 cm小块,将切块后的牛皮与6.67倍重碎冰(g/牛皮干基重)放入高速粉碎机中粉碎得皮浆。将皮浆分别与添加了0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%(w/w)的软木纤维素或0.5%(w/w)其它亲水胶体的盐酸溶液(0.96% w/w)1∶1混合并充分搅拌均匀。在4 ℃下,酸化膨胀18～24 h,并间隙搅动后,经高压均质机(275 bar)均质1次后真空搅拌脱气。所用真空搅拌脱气参数为:搅拌速度200 r/min,真空度0.8 MPa。

1.2.3 胶原蛋白肠衣膜的制备 将脱气后的胶原团挤压制成片状,并于3% NaOH溶液(w/V)中浸泡1 min中和盐酸,随后水洗至中性,最后在25 ℃干燥24 h并于53% RH(25 ℃)的亚克力干燥箱内回湿72 h得胶原蛋白肠衣膜。

1.2.4 胶原蛋白肠衣膜干态抗拉强度和断裂延伸率测定 将胶原蛋白肠衣膜剪成5 cm×1 cm的长方形,采用物性测试仪测定样品在干态下的抗拉强度、断裂延伸率,重复3～5次,取平均值。测试条件:夹具A-MTG;测试参数:触发力10 g;测前速度:0.5 mm/s;测试速度0.5 mm/s;测后速度0.5 mm/s;下压距离:4 mm。计算公式如下:

抗拉强度(MPa)=断裂力(g)/横截面积(mm2)

式(1)

断裂延伸率(%)=断裂伸长长度(mm)/原长度(mm)×100

式(2)

式中:原长度以夹具之间的距离计,为3 cm;膜厚度采用螺旋测微器测定,作为测试参数输入。

1.2.5 胶原蛋白肠衣膜湿态抗拉强度和断裂延伸率的测定 将剪好的肠衣膜放于25 ℃水中浸泡1 min后,取出用滤纸吸干表面水分,其他方法同1.2.4。

1.2.6 胶原蛋白肠衣热收缩率测定 将肠衣膜剪成5 cm×1 cm的长方形,在煮沸的水中浸泡1 min后取出测定长度变化,重复2～3次,取平均值。

热收缩率(%)=(原长度-煮后肠衣膜长度)/原长度×100

式(3)

式中:原长度为5 cm。

1.2.7 胶原蛋白肠衣膜溶胀率测定 取一定重量肠衣膜计M1,放入室温的水中浸泡24 h后,在滤纸上吸干水分后称重计M2,测定肠衣膜的吸水情况[13],重复2～3次,取平均值。

溶胀率(%)=(M2-M1)/M2×100

式(4)

1.2.8 胶原蛋白肠衣膜的色泽及透明度的测定 将肠衣膜剪成5 cm×5 cm后,用高精度分光测色仪测定胶原蛋白肠衣膜的色泽,结果用L*、a*、b*值表示[14]。将肠衣膜剪成2 cm×5 cm后,用紫外分光光度计测定不同组肠衣膜的透过率,并用螺旋测微计测定肠衣膜的厚度,透明度(T)计算公式如下[15]:

T=lg T530/L

式(5)

式中:T530为样品在530 nm条件下的透光率(%);L为膜的厚度(μm)。

1.2.9 胶原蛋白肠衣膜水接触角测定 将胶原蛋白肠衣膜剪成2 cm×5 cm的小条贴在样品台上,保持膜表面水平,用2.0 mL微量注射器注射5 μL去离子水于膜表面,在膜还没有开始溶胀前就测定肠衣膜的水接触角,接触角由软件自动生成,结果重复3遍,取平均值[16]。

1.2.10 胶原蛋白肠衣膜差式扫描量热分析 将胶原蛋白肠衣膜剪成2 cm×2 cm的小块,放置于53% RH(25 ℃)的密闭亚克力干燥箱内平衡72 h后,肠衣膜水分含量约14%,用201 F1 DSC测定。测试条件:固体盘扎孔,扫描温度范围25～180 ℃,升温速率5 ℃/min[17]。

1.2.11 胶原蛋白肠衣膜红外光谱分析 将胶原蛋白肠衣膜剪成2 cm×2 cm的小块,放置于0% RH(25 ℃)的亚克力干燥箱内干燥72 h后,用傅里叶红外光谱仪进行光谱分析,测试条件:4000～400 cm-1,扫描次数为32次,分辨率为8 cm-1[18]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 软木纤维素添加量对胶原蛋白肠衣膜性能的影响

本研究首先制备5种不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜,分析添加量对胶原蛋白肠衣膜性能的影响。

2.1.1 软木纤维素添加量对肠衣膜抗拉强度的影响 如图1所示,当添加了软木纤维素后,胶原蛋白肠衣膜的干态抗拉强度,有了不同程度的下降,并具有显著性(P<0.05)。这可能由于纤维素的填充破坏了胶原蛋白肠衣膜基质原有的结构,使得初始结合紧密的膜基质变得疏松,阻碍了胶原分子间的相互作用,从而导致了肠衣膜干态抗拉强度的下降[19]。湿态的抗拉强度远小于对应添加量的干态肠衣膜,这是由于水分的浸入破坏了干态时维持其结构的大量的氢键。此外,肠衣膜的湿抗拉强度随着纤维素添加量的增多呈现先增大后逐渐减小的趋势,当纤维素添加量为0.5%时达最大。这说明少量的纤维素能够复合增强肠衣膜结构,当其添加量增大到一定程度时,过量的纤维素开始堆积,破坏了胶原分子之间的作用力,从而导致膜强度的减小[19]。肉制品的水分含量通常很高,无论在灌肠还是运输过程中,肠衣膜的湿态抗拉强度都发挥着至关重要的作用。

图1 不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的抗拉强度Fig.1 Tensile strength of collagen casing films with different cork cellulose additions注:图中相同指标不同字母表示统计学上存在显著差异(P<0.05);图2～图5、图7～图10同。

2.1.2 软木纤维素添加量对肠衣膜断裂延伸率的影响 如图2所示,胶原蛋白肠衣膜的干态断裂延伸率随着软木纤维素用量的增加而略微降低。当纤维素添加量达到2.0%时,干态断裂延伸率剧烈下降(P<0.05)。同抗拉强度的变化,当软木纤维素含量较高时,大量的纤维素会发生相互聚集,破坏了膜内分子间次级键的稳定,导致胶原蛋白肠衣膜更易发生断裂[20]。当肠衣膜浸湿后,这种稳定肠衣膜结构的次级键被进一步破坏,水分子的润滑作用使得胶原分子之间的错位移动变得更容易,因而断裂延伸率较干态有明显的提升。此时发挥作用的主要是胶原之间以共价键形成的网络结构,因而纤维素的填充并不会对肠衣膜的湿断裂延伸率产生较大影响。

图2 不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的断裂延伸率Fig.2 Elongation of collagen casing films with different cork cellulose additions

2.1.3 软木纤维素添加量对肠衣膜热收缩率、溶胀率的影响 如图3A所示,软木纤维素的加入降低了胶原蛋白肠衣膜的热收缩率,改善了肠衣膜遇热收缩的问题。当纤维素添加量为2.0%时,肠衣膜的热收缩率仅约为25%,显著降低(P<0.05)。这主要是因为胶原纤维网络结构中填充的较多软木纤维素,会使得胶原遇热时不易相互靠拢,从而改善了肠衣膜的热收缩率[19]。此外,如图3B所示,肠衣膜的溶胀率也随纤维素加入而降低,原因可能是当胶原纤维吸水溶胀后原本水分子的空间被纤维素颗粒占用,而软木纤维素具有较高的结晶度,属水不溶性纤维素,且其持水能力低于胶原纤维,故导致肠衣膜吸水能力降低,即溶胀率下降[21]。

图3 不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的热收缩率(A)与溶胀率(B)Fig.3 Swelling rate and heat shrinkage rate of collagen casing films with different cork cellulose additions

2.1.4 软木纤维素添加量对肠衣膜透明度的影响 本研究通过紫外分光光度计测定肠衣膜的透明度[22-24]。如图4所示,加入软木纤维素后,肠衣膜的透明度明显下降,说明纤维素不可用量过高,如果过高会导致实际使用中影响肉制品的观感,根据图4的实验结果,纤维素的添加量一般不宜超过1.0%。

图4 不同纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的透明度Fig.4 Transparency of the collagen casing films with different cork cellulose additions

2.1.5 软木纤维素添加量对肠衣膜水接触角的影响 如图5所示,加入软木纤维素后,胶原蛋白肠衣膜的水接触角有一定程度的下降,表明肠衣膜的亲水性增加,这可能的原因是纤维素本身带有-OH等亲水基团,使得胶原蛋白肠衣膜的水接触角略有降低[25]。且随着纤维素添加量的增加,肠衣膜的水接触角有更明显的下降,这与Chen等[26]的结果保持一致。当纤维素的添加量达到1.5%时,即使再加入更多的纤维素,肠衣膜的水接触角也不会降低。

图5 不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的水接触角Fig.5 The water contact angle of collagen casing films with different cork cellulose addition

2.1.6 软木纤维素添加量对肠衣膜变性温度的影响 如图6所示,相比于对照组的胶原蛋白肠衣膜的热变性温度(66.2 ℃),加入了0.5%、1.0%、1.5%和2.0%软木纤维素的胶原蛋白肠衣膜的热变性温度有较为明显的提高,分别为79.4、75.6、73.5和79.0 ℃。为排除水分蒸发的干扰,前期实验中将其中的一张膜放在干燥器中10 d,发现仍可观察此峰,故确证此峰为胶原纤维的变性峰。一般而言,当提取的牛皮胶原蛋白在溶液状态下测定时,其变性温度约为37 ℃[27]。但因肠衣膜中的胶原蛋白状态为干态,水分含量低,且大多以胶原纤维的形式存在,相当于重度脱水处理的胶原蛋白,故而热变性温度偏高[28]。其中,当纤维素的添加量为0.5%和2.0%时,肠衣膜热稳定性较好。

图6 不同软木纤维素添加量的胶原蛋白肠衣膜的变性温度Fig.6 The denaturation temperature of collagen casing films with different cork cellulose additions

综上所述,当软木纤维素添加量为0.5%时,胶原蛋白肠衣膜的干、湿态抗拉强度均得到明显的提升,肠衣的热收缩率和溶胀率出现明显降低,同时热稳定性得到了明显的提高。肠衣膜的这种变化,更有利于满足其实际的应用需求。

2.2 亲水胶体种类对胶原蛋白肠衣膜性能的影响

2.2.1 亲水胶体种类对肠衣膜干、湿态抗拉强度的影响 本研究进一步选取了3种水不溶性亲水胶体:软木纤维素、微晶纤维素和竹纤维素,4种水溶性亲水胶体:魔芋胶、瓜尔胶、HPMC和PGA加入到胶原团中进行实验。为减少其他因素的影响,且将差异值最大化,在探究其他亲水胶体种类对胶原蛋白肠衣膜性能的影响时,综合考量,将亲水胶体添加剂的用量选为0.5%。如图7A所示,HPMC组的干态抗拉强度最大,竹纤维素组的干态抗拉强度最小,相比于水溶性亲水胶体组,水不溶性组肠衣膜的干态抗拉强度明显较低。其可能的原因是纤维素破坏了胶原纤维膜基质的初始结构。如图7B所示,胶原蛋白肠衣膜的湿态抗拉强度的结果与干态抗拉强度相反,加入水不溶性亲水胶体的肠衣膜要高于水溶性亲水胶体组,可能的原因是在湿态下,胶原纤维膜基质结构中有充分的空间容纳纤维素,纤维素颗粒填充在胶原纤维之间,使得胶原纤维之间的相对移动困难,使得肠衣膜的湿抗拉强度增加[19]。

图7 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的抗拉强度Fig.7 Tensile strength of collagen casing films with different hydrocolloids注:A:干态抗拉强度;B:湿态抗拉强度。

2.2.2 亲水胶体种类对肠衣膜干、湿态断裂延伸率的影响 如图8A所示,加入亲水胶体后,胶原蛋白肠衣膜的干态断裂延伸率浮动变化。当加入微晶纤维素时,肠衣膜的干断裂延伸率最大,约22%,而加入PGA时,肠衣膜的干断裂延伸率最小,约9%。如图8B所示,加入亲水胶体后,肠衣膜的湿态断裂延伸率在30%～45%之间,其中加入竹纤维后,肠衣膜的湿断裂延伸率最大,但相对于其他组的胶原蛋白肠衣膜来说未表现出显著性差异(P>0.05)。

图8 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的断裂延伸率Fig.8 Elongation of collagen casing films with different hydrocolloids注:A:干态断裂延伸率;B:湿态断裂延伸率。

2.2.3 亲水胶体种类对肠衣膜溶胀率、热收缩率的影响 如图9A所示,当加入HPMC时,胶原蛋白肠衣膜的溶胀率最小,其次是软木纤维素、竹纤维素,这说明在这三种肠衣膜内胶原纤维的网络结构能容纳的水分子较少。如图9B所示,水溶性亲水胶体对肠衣膜热收缩率的改善要好于水不溶性亲水胶体,当加入瓜尔胶与魔芋胶时,胶原蛋白肠衣膜的热收缩率最小,约30%。在肠衣膜内只加入纤维素时,并不能较大程度地改变肠衣膜的热收缩性。这说明水溶性亲水胶体在胶原蛋白肠衣中有较好的应用前景与可能。

图9 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的溶胀率(A)与热收缩率(B)Fig.9 Swelling rate(A)and heat shrinkage rate(B)of collagen casing films with different hydrocolloids

2.2.4 亲水胶体种类对肠衣膜透明度的影响 亲水胶体作为添加剂添加到胶原蛋白肠衣膜中,对肠衣膜的透明度有一定影响。如图10所示,水溶性亲水胶体组肠衣膜的透明度明显高于纤维素组的肠衣膜,当加入软木纤维素时,肠衣膜的透明度最小,为27。而当加入魔芋胶时,肠衣膜的透明度为35,此时胶原蛋白肠衣膜的透明度达到最大值。

图10 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的透明度Fig.10 Transparency of collagen casing films with different hydrocolloids

2.2.5 亲水胶体种类对肠衣膜水接触角的影响 如图11示,加入软木纤维素可以略微降低胶原蛋白肠衣膜的水接触角,而当加入水溶性亲水胶体时,肠衣膜的水接触角明显下降。加入瓜尔胶与PGA后,肠衣膜的水接触角下降最多,约为90°。加入其他水溶性亲水胶体的肠衣膜的水接触角也有较为明显的下降。而加入了纤维素的胶原蛋白肠衣膜的水接触角要明显高于加入了等量水溶性亲水胶体的肠衣膜。

图11 添加不同亲水胶体肠衣膜的水接触角Fig.11 Water contact angle of different hydrocolloid compound casing films

2.2.6 肠衣膜的FTIR光谱 如图12所示,胶原蛋白肠衣膜的-OH峰在3300 cm-1左右,-C-H峰在2900 cm-1左右。软木纤维素组的峰位置为3295.45和2923.74 cm-1,微晶纤维素组的峰位置为3293.49和2991.61 cm-1,竹纤维素组的峰位置为3296.33和2923.67 cm-1,瓜尔胶组的峰位置为3296.13和2920.65 cm-1,魔芋胶的峰位置为3293.84和2920.89 cm-1,HPMC组的峰位置为3304.19和2920.41 cm-1。PGA组的峰位置为3295.85和2922.60 cm-1。可知,亲水胶体不会对肠衣膜的化学键产生较大影响。

图12 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的红外光谱Fig.12 FTIR spectrum of collagen casing films with different hydrocolloids

2.2.7 肠衣膜的变性温度 如图13所示,瓜尔胶组的变性温度75.5 ℃,竹纤维素组的变性温度75.8 ℃,魔芋胶组的变性温度为72.4 ℃,软木纤维素组的变性温度为71.2 ℃,微晶纤维素组的变性温度为77.0 ℃,HPMC组的变性温度为78.7 ℃,PGA组的变性温度为81.2 ℃。可知,当加入魔芋胶或软木纤维素时,肠衣膜的热稳定性较差。而加入其它5种添加剂时,肠衣膜的热稳定性有明显提升。其中PGA组的热稳定性最好,胶原蛋白肠衣膜的变性温度高达81.2 ℃。

图13 添加不同亲水胶体胶原蛋白肠衣膜的变性温度Fig.13 Denaturation temperature of collagen casing films with different hydrocolloids

3 结论

软木纤维素的加入可使肠衣膜的湿抗拉强度明显增加,热稳定性提升,溶胀率下降,热收缩率略微降低。但当软木纤维素加入量过高时,肠衣膜的透明度较差。本研究确定了软木纤维素的合适添加量为0.5%。研究了不溶性亲水胶体软木纤维素、微晶纤维素、竹纤维素、可溶性亲水胶体魔芋胶、瓜尔胶、HPMC、PGA等7种亲水胶体(添加量均为0.5%)对肠衣膜性能的影响,结果表明,添加不溶性亲水胶体的肠衣膜厚度较高、透明度较低;微晶纤维素复配肠衣膜的机械性能、溶胀率、热收缩率及透明度优于软木纤维素和竹纤维素,而水溶性亲水胶体复配肠衣膜的机械性能相当,但瓜尔胶复配的肠衣膜具有最低的热收缩率。在未来的工作中,将进一步考察微晶纤维素、软木纤维素与瓜尔胶复配,深入分析复配方案对肠衣膜性能产生的影响,以期获得最佳性能的肠衣膜,将其更好的应用在胶原蛋白肠衣工业生产中。