丁昭宁，白文学，刘文兰，刘静，王晓玲，李杨，苏健，邓翠平

（重庆市江津区妇幼保健院产科，重庆402260）

染色体拷贝数变异（chromosome copy number variation，CNV）是引起人类遗传变异的重要形式之一， 其广泛存在于人类基因组之中。 研究显示，CNV 是由于基因组重排引起的结构变异， 多表现为亚显微水平基因组片段的微重复/微缺失等[1]。目前， 多种侵入性筛查手段在产前检查中能够检出染色体微重复/微缺失，如核型分析、比较基因组杂交、荧光原位杂交及微阵列技术等，不过此类检查手段存在一定的流产风险[2,3]，临床应用存在一定局限性。 对此，寻找一种高精度且非侵入性的产前检测手段以提高CNV 检出率具有重要临床价值。 本研究通过收集近年收治的接受无创产前基因检测（NIPT-plus）孕妇的临床资料，并与羊水细胞染色体核型分析结果进行一致性比较，旨在观察NIPTplus 在无创产前检测CNV 中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年3 月-2020 年3 月在江津区妇幼保健院产检中接受NIPT-plus 检测孕妇1014 例作为研究对象，年龄24-43 岁，平均（33.1±5.2）岁；孕周13-27 周，平均（22.3±1.0）周。 纳入标准：孕妇为B 超软指标异常、高龄妊娠（分娩年龄≥35 岁）、 血清学产前筛查高风险或临界风险者，怀疑胎儿CNV；均经孕妇同意并签署知情同意书后采集其外周血作为检测样本；排除标准：多胎及双胎妊娠者；孕妇1 个月内接受过免疫治疗、干细胞治疗、 移植手术者及一年内接受过异体输血者。 本研究经医院伦理委员会审核批准后实施。

1.2 方法

1.2.1 NIPT-plus 检测 ⑴样本采集：采用EDTA 抗凝管采血管抽取孕妇7-10ml 外周静脉血，在预冷离心机（4℃）内以1600r/min 的速率离心10min，收取上层血浆，并对初步分离的血浆再次离心，目的在于去除残存细胞。⑵提取游离DNA：采用磁珠法从合格血浆样本中裂解、 分离、 纯化并提取游离DNA，提取游离DNA 过程中需建立标准的质量控制体系，确保所提取的游离DNA 质量合格，能够满足下一步实验要求， 并确保其片段多态性有足够代表性。 ⑶制备测序文库：提取好的DNA 进行末端修复、补平，并进行测序接头、扩增及纯化，文库的制备要严格按照标准流程进行， 文库构建后的DNA 浓度要大于0.2ng/mg， 同时片段长度要在150-200bp 范围内[4]。⑷基因测序及数据分析：采用NextSeq CN500 高通量测序仪检测分析特定DNA片段的碱基序列， 并采用生物信息工具放大并分析不同染色体水平差异， 识别胎儿染色体非整倍体异常及相对高发的几种微缺失疾病， 最终确定胎儿罹患染色体非整倍性疾病种类及风险概率。对NIPT-plus 检测结果为高风险者进行遗传咨询，并征得孕妇知情同意前提下进行介入产前诊断。

1.2.2 羊水染色体核型分析 通过超声引导定位，然后经腹羊膜腔穿刺抽取孕妇羊水20ml， 离心后取0.5ml 沉淀、培养，得到分裂中期细胞，然后经过低渗、固定、吉姆萨染色等处理，最终进行染色体核型分析。

1.2.3 随访 通过电话或查阅本院电子病历记录等方式随访NIPT-plus 检测阴性孕妇的妊娠结局，包括有无流产、新生儿是否异常等。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0 软件做数据分析，用n(%)表示计数资料，并计算NIPT-plus 检查胎儿CNV 的阳性预测值。

2 结果

2.1 NIPT-plus 检测结果及阳性预测值 本组1014例高风险或B 超软指标异常孕妇经NIPT-plus 检测，共检出18-三体高风险3 例，21-三体高风险4例，13-三体高风险1 例， 微缺失3 例， 微重复2例，XO 高风险1 例，XXY 高风险1 例，45，XO 高风险1 例， 详见表1。 羊水染色体核型分析确诊为18-三体高风险3 例，阳性预测值100.0%；确诊为21-三体高风险4 例，阳性预测值100.0%，确诊为13-三体高风险1 例，阳性预测值100%，确诊为微缺失/微重复3 例，阳性预测值60%，确诊为性染色体异常2 例，阳性预测值66.7%。

2.2 随访结果 本组接受NIPT-plus 检测为阴性的998 例孕妇均获得随访并获知妊娠结局，无流产现象，未发现新生儿染色体异常现象。

3 讨论

NIPT 是一种通过对孕母外周血胎儿游离的基因（DNA）进行测序及生物信息分析的新方法，其在筛查胎儿染色体非整倍体患病风险方面可提供重要依据[5,6]，具有无创、灵敏度高等优点，近年来已逐步在临床推广应用。 NIPT 以检测21-三体、18-三体、13-三体等疾病为主要目标， 其检测准确性几乎达100%，不过对于染色体微重复/微缺失综合征缺乏有效的筛查指征[7,8]。 值得庆幸的是，贝瑞和康生物公司近年推出了升级版NIPT（NIPT-plus），其通过加深测序深度并以创新性的生物信息学算法大大增加了检测范围， 使得CNV 的检出率明显升高[9,10]。 目前，关于NIPT 在21-三体、18-三体、13-三体等疾病诊断中的价值研究较多， 但关于NIPT-plus 在胎儿染色体微重复/微缺失中的评估价值尚鲜有报道。

本研究结果显示，1014 例风险样本接受NIPT-plus 检测后共检出18-三体高风险3 例，21-三体高风险4 例，13-三体高风险1 例， 微缺失/微重复5 例，性染色体非整倍体3 例，经过核型分析显示，NIPT-plus 在检测18-三体、21-三体、13-三体中的阳性预测值均达100.0%， 与文献报道结果基本吻合[11,12]，其对微缺失/微重复的阳性预测值为60.0%， 性染色体异常阳性预测值为66.7%， 提示NIPT-plus 检测在评估CNV 风险方面有确切价值，但仍存在一定局限。 从本研究结果来看，NIPTplus 在检测微缺失/微重复及性染色体异常中均存在假阳性病例，分析可能原因为：首先，限制性胎盘嵌合、母体染色体嵌合、性染色体互换、胎盘滋养层细胞等因素均有可能导致NIPT-plus 提示性染色体非整倍体高风险[13]；其次，NIPT-plus 检测中也会受到孕妇自身异常DNA 的干扰[14,15]，从而导致无创结果与核型分析结果不符。 本研究中1 例微重复病例及1 例XO 高风险病例与核型分析结果不一致， 经随访发现孕妇继续妊娠且新生儿出生后未发现异常， 出现假阳性可能是因为此2 例患者是由于染色体微小片段的重复或异常所致，而NIPT-plus 检测可能对此还不够灵敏， 这提示NIPT-plus 检测还存在技术本身上的缺陷或不足。本研究的主要目的在于观察NIPT-plus 检测在提高产前CNV 筛查的准确性中的临床价值， 从而为降低产前诊断的技术风险提供依据，NIPT-plus 的无创性、准确性获得诊断医师的普遍认可，不过其也存在假阳性，且费用较高，可能造成产前过度诊断， 因此建议在临床中可作为高风险孕妇产前筛查的一种有效补充。 同时，本研究样本量较少，故所得结果还需加大样本量进一步验证。

综上所述，NIPT-plus 作为NIPT 的升级版，其在CNV 的检测中对常见疾病如18-三体、21-三体中的阳性预测值较高，而在微缺失/微重复、性染色体异常等的检测中阳性预测值尚有待提高， 希望随着检测技术的提高，NIPT-plus 在有效指导优生优育方面发挥更大作用。

表1 NIPT-plus 与羊水染色体核型分析结果比较