刘文博　唐浩远　王洪浩　唐樱冉　刘倩文　马荣荣　肖秀洳　张雪莹　孙洁

【摘  要】我国的海带产量居全球首位，具有完整的海带产业链。褐藻胶是海带细胞的主要成分，其降解产物褐藻寡糖等具有良好的生物活性，在医疗、食品、化工等领域得到广泛应用。较传统的物理法和化学法进行褐藻胶的降解，采用褐藻胶裂解酶的生物法降解褐藻胶具有高效性、可控性的等优点，使得挖掘高效的褐藻胶裂解酶成为褐藻胶加工产业的重点工作。

本文从荣成海带养殖区腐烂的海带中筛选具有褐藻胶裂解酶活性的菌株，以海藻酸钠为唯一碳源筛选获得了1株具有海藻酸钠降解活性的菌株，其最高酶活可达20.22 IU/mL。经鉴定确定其为海洋单胞菌属（Thalassomonas sp.）的一株细菌。

【关键词】海带;褐藻胶降解菌;筛选;鉴定

1. 引言

海带（Saccharina japonica）是褐藻纲海带科糖藻属的大型海藻。海带不仅是我们补充营养的优良食品，也因具有多种医疗作用，如降低血压^[1]、抗辐射^[2]、抗凝血^[3]、调节免疫及抗癌^[4]、促进智力发育^[5]、美肤美发^[6]等多种生理功能而成为一种经济价值较高的褐藻。

褐藻胶是海带细胞中的主要成分。褐藻胶由β-D-甘露糖醛酸及α-L-古洛糖醛酸两种糖醛酸单体通过1，4-糖苷键随机聚合而成的链状天然高分子杂多糖^[7]。褐藻胶具有独特的理化性质，如凝胶性及成膜性。此外其具有较好的生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抑菌、抗凝血、抗氧化作用，因此，褐藻胶在基础研究、医药开发、食品工业等领域展现出巨大的应用价值^[8-11]。

褐藻胶可被不同方式降解后能够得到一系列聚合度不同的低聚寡糖^[12]。目前常用的褐藻胶降解方法有：物理法、化学法、生物法。物理法降解程度不易控制，现已较少使用^[13]。化学法可分为酸降解法和氧化降解法。两种处理方式均具有反应剧烈、易造成污染环境的缺点，同时获得的产物的其生物活性易被破坏从而限制该方法的大规模使用^[14]。生物法又称酶解法，主要是通过褐藻胶裂解酶对褐藻胶进行生物降解。该法克服了物理法和化学法的部分缺点，具有产率高、反应条件温和、可控性强、无污染、产品生物活性高等特点而成为研究热点。

褐藻胶裂解酶来源广泛，目前主要从海洋藻类、软体动物、棘皮动物中分离获得。本论文从腐烂海带中筛选了一株高活性褐藻胶降解酶菌株，可为生物法降解褐藻胶获得褐藻寡糖提供高效的生物酶。

2.实验材料与方法

2.1实验材料

荣成海带养殖区采集腐烂的海带。

2.2 培养基

初筛培养基（g/L）：5g（NH₄）₂SO₄、2g K₂HPO₄、30g NaCl、1g MgSO4、0.01g FeSO₄、5g海藻酸钠、2%琼脂（固体培养基）、蒸馏水1000mL、pH7.5、121℃，灭30min。

发酵培养基（g/L）：5g蛋白胨、1g酵母膏、0.01g FeSO₄、海水1000mL、pH7.5、121℃，灭菌30min。

2.3菌株筛选

腐烂海带2g，加入5mL无菌海水，无菌棒碾碎，漩涡震荡1min，梯度稀释，取合适梯度涂布到初筛培养基上，15℃培养2-3天，挑取透明圈较大的菌株接種到发酵培养基中，于15℃150 rpm条件下培养48h，利用DNS法测定酶活。

2.4酶活测定

取1 mL粗酶液和0.75%海藻酸钠溶液于25 mL比色管中，振荡摇匀，40℃水浴20min，加1.5mL DNS，沸水浴5 min，冷却，定容，实验组做每组三个平行，以0.75%海藻酸钠和蒸馏水制成的溶液作空白对照，于520 nm下测吸光值。

酶活力单位（IU）定义：1 mL酶液在上述测定条件下，1min内水解底物产生1μg产物所需酶量定义为一个酶活力单位（IU/mL）。

酶活力公式：酶活力（IU/mL）=y×1000×n/t

式中：y为用DNS法测得OD值在葡萄糖标准曲线上对应的葡萄糖含量（mg）

n为酶液的稀释倍数

t为酶反应时间（实验中均为20min）

2.5菌株鉴定

测定16S rDNA保守序列，在NCBI数据库中进行比对，获取菌株信息，利用生物信息学软件MEGA构建系统进化树。

3.实验结果与分析

3.1 菌株筛选

挑取菌落周围有透明圈或凹陷的菌株，接种到发酵培养基上，进行复筛，DNS法计算菌株的酶活，实验得到菌株的酶活结果如图1所示。

从腐烂海带中，一共筛选出21株具有褐藻胶裂解酶活性的菌株，其中筛选获得最高酶活菌株的酶活力达到20.22 IU/mL，并将其命名为“GL1号菌”（图1A）。

3.2GL1号菌株生物量与产酶关系

为了探究GL1号菌株最佳产酶时间，在菌株培养不同时间点进行取样，同时测定酶活性和生物量（以OD600表示），实验结果如图2所示。

通过图2可知该菌株在36h达到生长高峰，随后细胞开始破碎死亡。在36h测得酶活力达到最大为24.10 IU/mL，随着菌不断的死亡，酶活力也随之减少。

3.3GL1号菌的分子生物学鉴定

3.3.1 16S rDNA扩增及菌株鉴定

由图3可知GL1号菌的16S rDNA片段的片段大小约为1200bp，利用NCBI中的核苷酸数据库，对测序结果进行BLAST分析，该菌株属于海洋单胞菌属Thalassomonas sp.

3.3.2菌株系统发育树分析

根据序列比对结果选取相似度较高的模式菌株，采用MEGA 7.0软件中的NJ法，构建GL1号菌株系统发育树，结果如图4所示：

由图4可知，目的菌株与海藻海洋单细胞菌Thalassomas actiniarum（NR 025717）在同一分支，亲缘关系最近。

结论

本研究从腐败海带中成功筛选到一株高活性的褐藻胶降解酶，并对其进行鉴定为海洋单胞菌属，为今后开发利用海带，提高海带的利用价值提供基础。

致谢

本论文是在黑龙江省大学生创新创业训练计划项目202010214067、202010214071资助下完成的。

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本论文是在黑龙江省大学生创新创业训练计划项目202010214067、202010214071资助下完成的。