宋翠薇， 艾丽梅

1锦州医科大学抚顺市中心医院研究生培养基地(辽宁抚顺 113006)； 2锦州医科大学附属第一医院血液科(辽宁锦州 121000)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞恶性增殖性疾病，发病占血液系统肿瘤的第2位，仅次于非霍奇金淋巴瘤，约占13%[1]。随着对其生物学、病理学和新的治疗方案的研究，患者的生存率和生活质量得到了显著提高。尽管对MM的研究取得了新进展，目前其仍是一种不可治愈的疾病[2]。微小RNA(microRNAs)是一类小非编码RNA，在包括肿瘤在内的人类代谢疾病中发挥重要作用[3]，因其在参与调节浆细胞发育和骨髓瘤发生中的关键作用而受到关注[4]，成为近几年研究热点。miRNAs作为致癌调节剂或肿瘤抑制剂，可能是癌症发生和发展的关键因子，miRNAs去调控与包括MM在内的几种恶性肿瘤的发病机制有关[5-6]。肿瘤抑制基因miRNAs通常在肿瘤细胞中表达下调和(或)缺失，它们的靶点是参与肿瘤细胞增殖和存活机制的mRNA。相反，发挥致癌作用的miRNAs在肿瘤细胞中过度表达，并通过靶向肿瘤抑制基因促进肿瘤发展，因此，取代下调的miRNAs或抑制过度表达的miRNAs可能是基于miRNAs癌症治疗的基本原理[5，7-8]。研究发现，miR-324-5p位于染色体17p13.1，在MM中其可能通hedgehog通路发挥作用，miR-324-5p在MM细胞中可能通过SCFβ- TrCPE3 连接酶抑制MM细胞的转移和侵袭，发挥抑癌基因的作用[9-10]。 miR-215-5p在MM中通过靶向RUNX1基因，抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活而发挥抑癌基因的作用[11]。这两种miRNAs在MM中研究较少，在MM患者血清中表达鲜见研究。因此本研究通过检测MM患者血清miR-324-5p及miR-215-5p的表达水平，研究其表达与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月至2019年10月就诊于锦州医科大学附属第一医院血液科的未进行造血干细胞移植的MM患者60例，年龄39～79岁，中位年龄62岁，门诊健康人20例(健康对照组)。多发性骨髓瘤患者为3组实验组：初治MM患者20例(初治组)，巩固治疗MM患者20例(巩固治疗组)和复发难治的MM患者20例(复发难治组)；其中巩固治疗组为疗效评估达部分缓解(PR)及以上的MM患者，包括完全缓解(CR)、非常好的部分缓解(VGPR)和部分缓解(PR)，难治复发组为经6个周期化疗后未达到PR的MM患者，包括疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)和微小缓解(MR)。所有病例符合MM诊断标准， 并排除自身免疫性疾病、中枢神经系统疾病、各种急慢性感染性疾病、其他恶性肿瘤等。

1.2 实验方法

1.2.1 血清样本收集 收集各受检者空腹静脉血3 mL于带有分离胶的真空采集管中，室温下，3 500 r/min离心5 min，离心后将上层血清分装于无RNA酶的1.5 mL EP管中，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 血清miRNA提取、反转录和定量 取200 μL血清用于miRNA提取(按照天根生化科技公司miRcute血清提取分离试剂盒说明书进行操作)；按照说明书操作步骤，取8 μL总RNA进行miRNA cDNA第一链合成；以U6为内参，实时荧光定量PCR检测血清中miR-324-5p、miR-215-5p的表达水平(试剂盒和引物购于天根生化科技公司，操作步骤参照说明书)。根据扩增曲线和溶解曲线判断反应质量，以2-ΔΔCt代表目的基因miRNA的相对表达水平，其中Ct值为扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数。

1.2.3 临床指标收集 收集患者和健康人入院时的临床指标，包括血红蛋白(Hb)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血小板计数(Plt)、β2微球蛋白(β2-MG)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酐。各临床指标均由经验丰富的检验医师对各受检者空腹静脉血进行检测获得。

1.3 生存分析 对20例初治MM患者进行生存分析，由于时间限制，选取无进展生存期(PFS)作为评判指标进行分析，随访时间截止到2019年11月30日，其中疾病进展的患者有7例。以中位数为节点，将MM患者血清miR-324-5p和miR-215-5p表达水平高于中位数组定义为高表达组，低于中位数组定义为低表达组。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0和GraphPad Prism 5统计软件进行实验数据结果的统计分析。计量资料用均数±标准差表示，多组之间的检验先采用单因素方差分析，服从方差齐性的多组间数据若整体存在差异，两两比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义；不服从方差齐性的多组数据间的检验采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Bonferroni校正进行比较， 检验水准α=0.008 3。运用Pearson相关比较两组数据的相关性，运用GraphPad Prism 5分析生存曲线，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-324-5p和miR-215-5p表达水平 各组患者和健康对照组miR-324-5p和miR-215-5p表达水平差异有统计学意义(2=23.77，52.47，P<0.001)。与健康对照组比较，各组MM患者血清中miR-215-5p表达水平下降(P<0.008 3)，初治组和难治复发组患者血清miR-324-5p表达水平下降(P<0.008 3)，巩固治疗组与健康对照组血清miR-324-5p表达水平差异无统计学意义(P>0.008 3)；各组患者间比较，巩固治疗组miR-324-5p表达水平高于初治组及难治复发组(P<0.008 3)；巩固治疗组血清miR-215-5p表达水平高于初治组(P<0.008 3)，巩固治疗组和难治复发组血清miR-215-5p表达差异无统计学意义(P>0.008 3)，初治组与复发难治组患者之间两种miRNAs表达水平差异无统计学意义(P>0.008 3)。见表1。

表1 各组血清miR-324-5p和miR-215-5p相对表达量

2.2 各组临床指标分析

2.2.1 Hb分析 健康对照组Hb水平高于初治组和难治复发组(P<0.008 3)，与巩固治疗组差异无统计学意义(P>0.008 3)；巩固治疗组血红蛋白水平高于难治复发组(P<0.008 3)，初治组与复发难治组和巩固治疗组之间差异无统计学意义(P>0.008 3)。见表2。

2.2.2 RDW分析 健康对照组RDW水平低于各组MM患者(P<0.008 3)，各组MM患者之间RDW差异无统计学意义(P>0.008 3)。见表2。

2.2.3 Plt水平分析 健康对照组Plt水平高于巩固治疗组(P<0.05)，与初治组和难治复发组之间差异无统计学意义(P>0.05)；巩固治疗组Plt水平低于初治组(P<0.05)，难治复发组与巩固治疗组和初治组之间Plt水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2.4 β2-MG水平分析 健康对照组β2-MG水平低于各组MM患者(P<0.008 3)；各组MM患者之间β2-MG差异无统计学意义(P>0.008 3)。见表2。

2.2.5 LDH水平分析 4组之间LDH表达水平差异无统计学意义(F=1.525，P=0.215)。

2.2.6 肌酐水平分析 健康对照组肌酐水平低于初治组和复发难治组(P<0.008 3)，与巩固治疗组间差异无统计学意义(P>0.008 3)；各组患者间肌酐水平差异无统计学意义(P>0.008 3)。见表2。

表2 各组的临床指标

2.3 miR-324-5p、miR-215-5p与各临床指标的相关性分析 miR-324-5p表达水平与β2-MG呈负相关(r=-0.571，P<0.001)；与Hb呈正相关(r=0.465，P<0.001)；与RDW呈负相关(r=-0.367，P<0.001)。miR-215-5p表达水平与β2-MG呈负相关(r=-0.505，P<0.001)；与Hb呈正相关(r=0.559，P<0.001)；与RDW呈负相关(r=-0.392，P<0.001)。血清miR-324-5p、miR-215-5p表达水平与血小板计数、LDH、肌酐无相关性，见图1～6。

图1 血清miR-324-5p与β2-MG相关性 图2 血清miR-215-5p与β2-MG相关性 图3 血清miR-324-5p与血红蛋白相关性

图4 血清miR-215-5p与血红蛋白相关性 图5 血清 miR-324-5p与RDW相关性 图6 血清miR-215-5p与RDW相关性

2.4 miR-324-5p和miR-215-5p与MM预后分析

2.4.1 血清miR-324-5p表达水平与MM预后分析 初治组患者血清miR-324-5p表达水平中位数0.347，以中位数为界限划分，高表达组10例，低表达组10例。高表达组和低表达组PFS存在差异，高表达组PFS高于低表达组(P=0.031)，见图7。

图7 初治MM患者不同miR-324-5p表达水平 PFS 分析

2.4.2 血清miR-215-5p表达水平与MM预后分析 初治组患者血清miR-215-5p相对表达水平中位数为0.402，以中位数为界限划分，其中高表达组10例，低表达组例10例。两组之间PFS存在差异，高表达组PFS较低表达组延长(P=0.009)，见图8。

图8 初治MM患者不同miR-215-5p表达水平PFS 分析

3 讨论

微小RNAs(microRNAs)是一类小的非编码RNA，约由22个核苷酸组成，通过与靶基因3′端非翻译区以互补配对的方式结合[12]，导致靶基因降解或翻译被抑制，从而对基因转录后水平进行调控。miRNAs在转录后水平调节约30%的基因，因此与肿瘤的发生和发展密切相关[13]。研究表明，miRNAs可能与体外调节细胞凋亡、增殖、分化、代谢、侵袭和迁移有关[14-15]。在过去几年中，一些研究已经发现 miRNAs作为MM的预后和诊断生物标志物的潜在作用[16-17]。研究发现，血浆、血清、唾液和尿液等各种体液存在miRNAs的表达，并且作为一种侵入性小的标记物引起注意[18]。有研究对MM血清中miRNAs表达进行分析，在新诊断的MM患者中发现了95个表达失调的miRNAs。研究发现miR-19a和miR-4254联合检测可以区分MM和健康人；而且miR-19a低表达与国际分期系统(ISS分期)进展、del(13q14)和1q21扩增呈正相关，而分期和基因缺失、扩增与疾病的发生、进展密切相关。此外，血清miR-19a的表达下调导致患者的PFS和总生存率(OS)显著降低，血清miR-19a低表达提示预后不良[17]。由此可见，miRNAs在MM诊断、预后判断中具有指导意义。

有研究发现，miR-324-5p在骨髓瘤浆细胞和人骨髓瘤细胞株中表达水平下降，并且随着危险分级的增加，其表达水平会下降，体外研究发现，miR-324-5p会抑制MM细胞的侵袭和转移，其在MM中可能发挥了抑癌基因的作用[9-10]。miR-215-5p在MM浆细胞和人骨髓瘤细胞中表达上调，miR-215-5p抑制骨髓瘤细胞增殖，诱导其凋亡，在MM中发挥抑癌基因的作用[11]。这两种miRNAs在MM中发挥了抑癌基因的作用，但在血清中表达水平尚未研究，基于此内容，本研究选取血清样本，检测血清中两种miRNAs表达水平，创伤性较小，易于操作。

为了确定MM血清中miR-324-5p和miR-215-5p表达水平，分析其表达与MM预后的关系，本研究选取不同疾病状态的MM患者检测血清中两种miRNAs表达水平。结果显示，与健康对照组比较，miR-215-5p在各组MM中表达水平降低，miR-324-5p表达水平在巩固治疗组和健康对照组之间无明显差异，在初治组和难治复发组患者中表达水平下降。巩固治疗组miR-324-5p表达水平高于初治组和难治复发组，巩固治疗组血清miR-215-5p表达水平高于初治组，这表明不同疾病病理状态，miR-324-5p和miR-215-5p表达水平可能不同，其表达水平失调可能与疾病密切相关。MM患者预后与ISS分期、R-ISS分期、LDH、异常基因等有关。本研究发现，两种miRNAs表达水平与β2-MG呈负相关，β2-MG反映肿瘤负荷，且与ISS分期密切相关，提示这两种miRNAs在一定程度上可以反映肿瘤负荷，ISS分期越晚，其表达水平可能越低。有研究发现，RDW表达水平升高提示预后不良，在一定程度上可以帮助判断患者预后[19]。本研究分析发现，患者RDW水平高于健康对照组，而且miR-324-5p和miR-215-5p表达水平与RDW存在负相关，这提示miR-324-5p和miR-215-5p表达水平可以帮助判断疾病预后。通过对初治MM患者选取无进展生存期进行生存分析发现，miR-324-5p和miR-215-5p不同的表达水平PFS存在差异，miR-324-5p和miR-215-5p高表达组PFS较低表达组延长，推断miR-324-5p和miR-215-5p表达水平和MM预后存在关系，其低表达可能是预后不良的指标。本研究检测miR-324-5p表达水平在MM患者血清中表达水平降低，这与之前研究其在人骨髓瘤细胞及骨髓液中表达水平一致[9-10]。miR-215-5p表达水平在MM患者血清中降低，这与人骨髓瘤细胞和骨髓瘤浆细胞表达不一致[11]，可能是因为体内细胞信号通路作用导致。有研究发现血清中miRNAs表达水平和细胞、骨髓液中表达不一致[16-17]。有待大量临床样本检测患者血清中两种miRNAs表达水平进一步证实。

综上所述，miR-324-5p和miR-215-5p可能在MM中发挥重要作用，血清miRNAs有望成为MM诊断、预后判断的侵袭性小的潜在生物标志物。未来检测其作用通路及靶点，选取大样本进行研究会更具有代表性，并对PFS和OS进行分析可以为MM治疗和预后提供更好的方向。