王晓春，张健，张延鹏，毛莉蓉

(安徽理工大学 医学院，安徽 淮南，232000)

结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)是一种普遍用于结核病筛查和临床诊断的传统方法，然而TST的某些局限性问题尚未解决，尤其是TST与大多数环境非结核分枝杆菌和卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株的交叉反应性而出现的低特异性问题[1-2]。在目前全球卡介苗普遍接种的大背景下，TST阳性不能有效区分是受到结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染，还是BCG接种引起的免疫反应，这使得TST在结核分枝杆菌感染中的应用受到了巨大的限制。除此之外，TST阳性随患者免疫力下降或缺陷而逐渐减弱甚至消失，其中最具有代表性的一类人群就是合并肺结核(pulmonary tuberculosis，TB)感染的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency syndrome，HIV)患者。研究[3-5]发现HIV感染者对TST的反应明显低于未感染HIV者，在合并结核菌潜伏感染(latent TB infection，LTBI)的HIV人群中使用TST检测对HIV患者的LTBI的辅助诊断有局限性。

相较于TST试验的限制性，γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)在辅助诊断结核分枝杆菌感染具有较高的特异性。IGRA是利用结核分枝杆菌特异性抗原刺激人外周血T淋巴细胞产生的γ-干扰素释放情况来判断患者是否为结核分枝杆菌感染的试验。但是结核分枝杆菌抗原的免疫原性和毒力不尽相同，结核分枝杆菌差异区域(region of differences,RD)基因是BCG菌株完整的缺失片段，这些基因近年来在结核病的免疫学诊断上具有重要的研究价值而备受关注[6]。以研究较为成熟的RD2为例，临床上已开始使用Rv3874编码的CEP10，Rv3875编码的ESAT-6多肽作为IGRA的刺激抗原[7]。本研究对结核分枝杆菌RD15基因Rv1976c进行克隆和原核表达，根据全血IFN-γ分析试验(whole blood IFN-γ release assay，WBIA)结果来评价抗原Rv1976c在结核病辅助诊断中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

结核分枝杆菌H37Rv毒株(山西长治医学院附属医院检验科)；E.coliDH5α、BL21(DE3)菌株(TianGen生物公司)；质粒pPROEX(Novagen公司)。

1.1.2 主要试剂

抗His鼠单抗(TianGen生物公司)；BamH Ⅰ，Hind Ⅲ，T4工具酶，质粒提取试剂盒和细菌基因组提取试剂盒(上海生工生物公司)；SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒(BBI 生命科学有限公司)；Ni-NTA蛋白纯化系统(德国QIAGEN公司)；人外周血IFN-γ ELISA检测试剂盒(深圳达科为公司)；内毒素去除试剂盒(南京金斯瑞公司)；rEC(融合蛋白ESAT6-CEP10，自制)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

分析pPROEX质粒、Rv1976c全序列相关对应的酶切位点设计引物，上游P1.TTCGGATCCCGGTGGATTGTCGACGGTATGAACG，下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点；下游P2.ATAAGCTTCTGCGTGCGGCGGGCCGCC，下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。PCR扩增条件：94.0 ℃，5 min；94.0 ℃，40 s；65.0 ℃，40 s；72.0 ℃，30 s，30个循环；72.0 ℃，10 min；得到扩增片段大小为408 bp。

1.2.2 重组质粒构建

通过细菌基因组提取试剂盒提取出结核分枝杆菌H37Rv毒株DNA作为模板，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ将PCR产物Rv1976与N端标记有6-His的pPROEX载体双酶切后纯化，再以T4连接酶过夜连接；使用Ca2+热休克法将连接产物导入E.coliDH5α菌株中过夜培养，得到重组质粒pPROX-Rv1976c，再以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切进行验证。

1.2.3 底物蛋白rRv1976c表达和纯化

将验证正确的重组质粒pPROEX-Rv1976c通过Ca2+热休克法转入E.coliBL21(DE3)菌株，过夜培养后以终浓度为0.5 mmol/L，体积为3 μL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，使用Ni-NTA蛋白系统进行纯化，再利用内毒素清除试剂盒清除内毒素(<0.1 EU/mL)，利用12%SDS-PAGE和蛋白质印迹法(鼠抗His单抗作为一抗，HRP标记羊抗鼠作为二抗)鉴定蛋白。

1.2.4 WBIA检测不同人群外周血抗原特异性IFN-γ水平

(1)研究对象分组

从山西省长治医学院和平医院募集符合临床诊断标准的32名受试者(排除合并免疫性疾病及HIV感染)进行问卷调查及全身体检，为了避免卡介苗接种的影响，根据rEC-WBIA检测结果，并联合临床诊断标准区分活动性肺结核患者(ATBs组)、潜伏感染者(LTBIs组)和健康对照者(HCs组)，见表1。

表1 研究对象分组及临床特征Table 1 Subject grouping and clinical characteristic

(2)WBIA试验

无菌采集受试者肝素化全血5 mL，6 h内加入无菌24孔板，每孔0.5 mL并以5 μg/孔 rRv1976c蛋白进行刺激，置37 ℃温箱孵育20 h(另设PHA和PBS为阳、阴性对照组)。刺激结束后，分离并收集上清液于灭菌EP管，使用人预包被IFN-γ ELISA试剂盒检测各孔IFN-γ浓度，根据标准孔OD值及浓度绘制出标准曲线，并根据标准曲线计算各孔IFN-γ的含量，各受检者以rRv1976c蛋白刺激后血清中IFN-γ的含量减去PBS刺激后血清中IFN-γ的含量即为rRv1976c蛋白诱导产生的特异性IFN-γ含量。

1.3 统计学处理

使用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，WBIA检测不同人群IFN-γ水平采用非参数U检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒pPROEX-Rv1976c构建和鉴定

PCR扩增的Rv1976c碱基大小为408 bp，插入pPROEX(+)构建出重组质粒pPROEX-Rv1976c，经过BamH Ⅰ，Hind Ⅲ双酶切鉴定质粒构建正确，见图1。

(a) 重组质粒pPROEX-Rv1976c构建模式图；(b) pPROEX-Rv1976c酶切鉴定图1 重组质粒pPROEX-Rv1976c构建和酶切鉴定Fig.1 Recombinant plasmid pPOEX-Rv1976c was constructed and identified by enzyme digestion

2.2 rRv1976c表达、纯化和蛋白质印迹分析

以Ca2+热休克法将重组质粒pPROEX-Rv1976c转入E.coliBL21(DE3)菌株，经IPTG诱导培养，表达的rRv1976c蛋白经Ni-NAT柱纯化后进行SDS-PAGE检测后，目的蛋白分子量大小为15.96 kD，与预期结果相符，见图2(a)。再经蛋白质印迹法确认其表达成功，见图2(b)。

图2 rRv1976蛋白表达、纯化和免疫印迹分析鉴定Fig.2 rRv1976 protein expression，purification and Western blotting analysis

2.3 rRv1976c诱导ATBs、LTBIs和HCs特异性IFN-γ水平比较

PHA诱导的ATBs和LTBIs，ATBs和HCs，LTBIs和HCs外周血中产生的IFN-γ水平之间均无统计学意义(u=0.124，0.100，0.082，均P>0.05),见图3(a)；rRv1976c刺激ATBs外周血T细胞产生的IFN-γ水平显著高于LTBIs，具有统计学意义(u=3.783，P<0.05)，rRv1976c刺激ATBs外周血T细胞产生的IFN-γ水平显著高于HCs，具有统计学意义(u=3.907，P<0.05)，rRv1976c刺激LTBIs外周血T细胞产生的IFN-γ水平显著高于HCs，具有统计学意义(u=3.674，P<0.05)，见图3(b)。

(a) rRv1976c刺激ATBs，LTBIs，HCs产生IFN-γ水平；(b) PHA刺激ATBs，LTBIs，HCs产生IFN-γ水平图3 PHA和rRv1976c诱导不同人群全血IFN-γ水平比较Fig.3 Comparison of whole blood IFN-γ levels induced by PHA and rRv1976c in different groups

3 讨论

随着结核分枝杆菌基因组学和细胞分子水平研究的深入以及结核病致病机制的逐步明确，CD4+Th1型细胞免疫应答被公认为与结核分枝杆菌感染密切相关。国内外研究[8-11]发现，结核分枝杆菌感染者CD4+T细胞受刺激所释放的Th1型细胞因子(尤其是IFN-γ)是结核分枝杆菌感染机体的一项重要免疫标志，由此IGRA逐渐成为近些年辅助诊断结核病的新型免疫学方法。

目前临床上主要通过T-SPOT和ELISA两种IGRA方法来辅助诊断结核分枝杆菌感染者，且两种方法均采用来自结核分枝杆菌的特异性刺激性抗原(CFP-10和ESAT-6)。现在证实IGRA比TST更具备特异性，且不受BCG的干扰[8-9]，可有效提高结核分枝杆菌感染者的检出率。然而，IGRA亦有缺陷，主要体现在检测方法、检测对象上存在差异性。首先有研究[10]发现在年龄超过60岁的老年结核病患者检测中，T-SPOT的敏感性较ELISA明显降低。此外，使用T-SPOT在马来西亚人群结核病检测敏感度上也较中国患者显著降低[11]。其次，即使检测特异性针对的是结核分枝杆菌的和接种过的BCG菌株，由于存在某些非结核分枝杆菌菌株引起的交叉反应，使得检测特异性降低[12]。再则，在免疫系统受损的受试者中以及5岁以下的儿童也可能会出现假阴性结果[13-14]。由此可见，搜索并测试结核分枝杆菌感染者特异性强、敏感度高的免疫标志物，从而用于结核病的有效诊断和预防，势在必行。

由于20世纪60年代冻干技术未被发明，BCG传代培养中基因发生缺失，缺失的片段通称为RD。RD基因序列从RD1到RD16包括了16个区域，一共129个开放阅读框。研究[15-17]揭示许多RD潜伏期抗原可以在结核病的诊断中作为潜力靶抗原。有研究[15]成功表达出了结核分枝杆菌RD潜伏期抗原Rv1985c并利用其作为T-SPOT底物，在检测活动性和潜伏性结核患者的灵敏度，分别达到71%和55%，在健康对照组中达到96.7%的特异性，这表明rRv1985c可能成为一种血清学诊断指标。除此之外，RD的Rv3824，Rv3825，Rv1980c和Rv1984c编码的分泌型抗原CEP10，ESAT-6，MPT64和CFP21同样能够引起机体强烈迟发型超敏反应[7，16]，其中以CEP-10和ESAT-6底物蛋白的IGRA试剂盒已经在临床上使用[11]，而MPT64也已被广泛应用于血清抗体快速检测试剂盒[17]。此次选择构建并表达的结核分枝杆菌 RD15抗原rRv1976c，其诱导ATB患者和LTBI患者产生IFN-γ的水平均要显著高于健康对照组，显示出Rv1976c可被结核分枝杆菌感染者外周血T细胞所特异性识别，这显示rRv1976可能是一种具有潜力的辅助诊断结核病的靶抗原。

值得一提的是，本研究诱导结核分枝杆菌感染者外周血T细胞产生的IFN-γ水平偏低，而健康人群产生的IFN-γ更低，这可能是由同一个体不同的疾病感染阶段对同一抗原的免疫应答不同、个体差异性以及样本量偏少所引起的。但是ATB患者、LTBI患者和健康人群产生的IFN-γ差异有统计学意义，这表明以绝大多数在BCG基因组中缺失结核分枝杆菌的RD抗原为基础的血清学诊断具有独特的优越性，在之后的研究中若是能够联合应用多种RD抗原或联用佐剂可能会有效提高检测的敏感性和特异性。