王栋洋，苏倩，雷丽，李卿

(湘南学院附属医院，湖南 郴州，423000)

肾癌是临床常见的泌尿系统肿瘤，其发病率仅次于膀胱肿瘤、前列腺癌，在泌尿系统的恶性肿瘤中位于第三。相关数据统计全世界每年有10万的患者死于肾癌[1]。手术是治疗肾癌的主要手段，但其术后复发和转移率为20%～30%，而且部分晚期患者无法进行手术治疗[2]。放射治疗和化学药物治疗(以下简称放疗和化疗)对肾透明细胞癌均不敏感，且副作用较大，疗效不理想，因此寻找疗效明显且毒性低的药物就成为临床研究的热点[3]。二烯丙基二硫(DADS)是大蒜的主要有效成分中的一类低分子量脂溶性化合物，研究已经证实具有抗肿瘤的作用，但其对肾癌的作用效果和作用机制研究较少[4]。为了观察DADS对肾癌ACHN细胞的增殖和侵袭的影响，我院进行了本次研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

人肾癌ACHN细胞(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，RPMI-1640培养基(美国GIbco公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)，DADS，MTT(美国sigma公司)，Annexin V-FITC & PI凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，兔抗人Livin抗体、兔抗人Akt抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

肾癌ACHN细胞使用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.2 MTT实验

收集对数期细胞，使用胰酶消化成单细胞悬浊液，在96孔板加入细胞100 μL/孔，放置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱孵育，分别加入10，20和40 μg/mL的DADS孵育，每孔加入20 μL 1×MTT，在37 ℃下培养4 h，去上清液，每孔加150 μL DMSO，低速震荡10 min，酶标仪在570 nm波长下检测光密度(optical density,OD)。细胞存活率=(加药细胞OD-本底OD)/(对照细胞OD-本底OD)×100%。抑制率=1-存活率。

1.2.3 流式细胞检测

取对数生长细胞，使用胰酶消化成单细胞悬浊液，均匀接种平底培养板，24 h后加入0(对照组)，10，20和40 μg/mL的DADS，分别继续培养12，24和48 h。收集悬浮细胞离心(肾癌ACHN细胞经不同浓度DADS (10，20和40 μg/mL)作用48 h后，胰酶消化后收集贴壁细胞，用PBS洗涤细胞培养瓶2次并收集清洗液，将清洗液置于离心机中，以2000 r/min离心5 min)，使用PBS洗涤细胞2次，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，加入5 μL Propidium Iodide混匀，在室温、避光条件下反应5～15 min，使用流式细胞仪检测各个细胞周期中的细胞比例。

1.2.4 蛋白质印迹法

取生长良好的细胞进行接种、培养，加入20 μg/mL浓度的DADS，收集细胞2次，加入裂解液裂解细胞后离心，并进行分装，BCA蛋白定量检测蛋白浓度，将各样本蛋白浓度调整至一致后进行点样。配置好分离胶和浓缩胶，准备好滤纸和纤维素膜，置入到转膜槽中进行转膜。漂洗3次后置入4 ℃下封闭过夜。封闭膜用Western洗涤2～3次，置于一抗溶液后密封，室温摇床孵育，然后用缓冲液漂洗，加入到封闭的二抗溶液中后再次孵育、漂洗。涂抹在PVDF膜上进行电泳跑胶，以GAPDH作为内参对照，比较目的条带的灰密度值，并行半定量分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 DADS对肾癌ACHN细胞抑制作用

MTT结果显示：肾癌ACHN细胞在不同浓度的DADS作用下，OD570均明显低于对照组，且随浓度增加而降低；在相同浓度的DADS作用下，肾癌ACHND的OD570随时间增加而升高，且具有统计学差异(P<0.05)，见表1。在同一时间点，DADS对肾癌细胞的抑制率随DADS的浓度增加而增加，在同一DADS浓度下，抑制率随时间的增加而增加(P<0.05)。见表2。

表1 不同浓度DADS作用于肾癌ACHN细胞不同时间的OD570值Table 1 OD570 values of ACHN cells treated by DADS at different concentrations and different time periods

表2 不同时间、不同浓度的DADS对肾癌抑制率Table 2 Inhibitory rate of DADS for renal cancer at different time and concentration

2.2 不同浓度DADS对肾癌ACHN细胞的凋亡作用

流式细胞结果提示肾癌ACAN细胞经DADS作用48 h后，其凋亡率随DADS浓度的增加而增加，且不同组别之间具有统计学差异(P<0.05)，见表3。

表3 不同浓度DADS对肾癌ACHN细胞的凋亡作用Table 3 Apoptosis of ACHN cells in renal carcinoma at different DADS concentrations(%，

2.3 DADS对肾癌ACHN细胞Livin和Akt蛋白的影响

蛋白质印迹法检测肾癌ACHN细胞用药前及经20 μg/mL浓度的DADS作用24 h后Livin和Akt蛋白的表达水平，并重复3次实验，结果提示加药组Livin蛋白和Akt蛋白表达水平的IOD值均低于未加药组，且均具有统计学差异(P<0.05)，见图1和表4。

图1 两组肾癌ACHN细胞Livin蛋白和Akt蛋白表达水平Fig.1 Expression protein levels of Livin and Akt in ACHN cells of two groups of renal carcinoma

表4 两组肾癌ACHN细胞Livin蛋白和Akt蛋白表达水平的条带灰度值Table 4 Gray values of Livin and Akt expression protein levels in ACHN cells of two groups of renal carcinoma

3 讨论

肾细胞癌是一种发生于肾脏的恶性肿瘤，其中腺癌在肾脏恶性肿瘤中占90%，是泌尿系统中常见的疾病[5]。肾癌的治疗以手术为主，近年来过继免疫、干扰素等应用为肾癌的治疗提供了新的手段，但是都具有副作用大，疗效不确切的问题[6]。

DADS是一种有机硫化合物，可在大蒜中提取，因此也称为大蒜素。临床研究[7]发现DADS具有解毒作用、抗菌作用，能够预防结直肠癌，防止心血管疾病的发生。同时DADS对人肝癌HepG2细胞以及人鼻咽癌CNE2细胞的生长也具有抑制作用，但是对于肾癌细胞的作用研究较少[8-9]。DADS的抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞的凋亡和分化来实现的，这种作用能够降低肿瘤细胞的浸润程度，延缓肿瘤细胞的生长周期，抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管的形成[10]。

细胞凋亡是一种十分常见的生物现象，多数调节因子都能够较好地控制整个细胞凋亡的过程，并且与一系列基因激活、调控以及表达等作用有关。如果细胞凋亡的过程处于一个混乱的状态，就可能会引发多种疾病，如引发肿瘤。凋亡抑制蛋白属于内源性细胞凋亡抑制因子的一种，它能够对细胞的凋亡起到一定的抑制作用，而对细胞的增殖起到良好的促进作用。IAPS家族中新成员Livin能够十分有效地抑制细胞凋亡，并且具有肿瘤组织表达特异性。Livin是凋亡抑制蛋白家族中的成员之一，也被称为肾凋亡抑制蛋白，具有2个氨基端的BIR结构和功能性羧基端的锌指结构，这2个结构能够通过内、外2种凋亡途径使Livin获得抗凋亡的作用，通常在肿瘤患者中会出现高表达[11-12]。袁和兴等[13]对69例肾癌患者进行了Livin相关研究，结果发现Livin表达的阳性率为43.5%，明显高出正常的肾脏组织，而且发现肿瘤的浸润深度和Livin表达具有相关性，Livin水平会影响患者预后。程涛等[14]研究发现Livin在肾透明细胞癌中呈现高表达，而癌旁组织中为低表达。PI3K/Akt信号通路是调节细胞衰老、凋亡、增殖等进程的重要信号通路，能够激活多个种类的生长信号通路，阻断多个凋亡信号通路，从而对肿瘤细胞的凋亡进行调节。PI3K/Akt信号通路在一些慢性疾病的防治中起保护作用，例如糖尿病。封芬等[15]研究证实黄连素对糖尿病大鼠大血管病变的防治作用与PI3K/Akt信号通路有关。在本研究中，经过DADS处理后的加药组，Livin和Akt蛋白表达的IOD水平均明显降低，说明DADS可能是通过下调Livin和Akt蛋白来起到抑制肾癌细胞增殖和侵袭的作用[16]。

综上所述，DADS对肾癌ACHN细胞具有显著的抑制增殖、促进凋亡的作用，而DADS促进人肾癌ACHN细胞的凋亡机制可能与下调Livin和Akt蛋白水平相关。对DADS的研究可能为肾癌的治疗提供新的途径，具有重要的研究价值。