李帅，韩思奕，唐莹，刘雨心，王瑞璇，颜少华，秦旭平

(南华大学 1.药物药理研究所；2.衡阳医学院，湖南 衡阳，421001)

静脉炎是由于化学、机械、感染和患者自身等因素刺激血管引起的炎症，通常表现为静脉所在部位的不适、疼痛、硬化、红疹以及静脉的条索状变化，是临床静脉输液常见的并发症[1]。静脉炎的发生会增加患者的住院时间和治疗费用，更严重者会导致菌血症的发生[2]。研究发现外敷马铃薯[3]及芦荟[4]对静脉炎有治疗作用，其有效成分还不清楚。因此，建立筛选马铃薯和芦荟的抗炎活性物质模型并验证其药理作用对发挥中草药外敷防治静脉炎优势有重要意义。本实验通过建立马铃薯和芦荟的有效成分马铃薯糖苷生物碱和芦荟蒽醌类物质的提取方法，并检测其混合物对小鼠尾静脉炎的治疗作用，为研制治疗静脉炎药物提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

101-4AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；HL-1000A型高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)；电子天平[梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司]；KQ5200DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用蒸发泵(上海鹰迪仪器设备有限公司)；旋转蒸发仪RE-200A(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；UNIVERSAL 32R冷冻离心机(德国Hettich公司)；UV-1750紫外可见分光光度计(SHIMADUZU公司)；自制小鼠固定器。

1.2 材料及药物

马铃薯(市场购买，发芽处理)；新鲜库拉索芦荟(市场购买)；α-茄碱标准品(北京百灵威科技有限公司，批号：LI50S18)；1，8-二羟基蒽醌标准品(成都艾科达化学试剂有限公司，批号：201703161)；5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司，批号：FA180119)；硫酸镁(河南华凯生物科技有限公司，批号：180602)；无水乙醇、浓硫酸、氨水、冰醋酸等均为分析纯(湖南汇虹试剂有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级昆明小鼠32只，雌雄各半，体质量(22±3)g，由南华大学动物部提供，动物质量合格证号：1107471911000001；许可证号：SCKX(湘)2015-0002。所有小鼠在南华大学动物部屏障系统中饲养。

1.4 马铃薯糖苷生物碱的提取及测定

参考文献[5]的方法，新鲜马铃薯放在阳光充足、水分充足、室温条件下作发芽处理。数周后马铃薯发芽变绿，削取马铃薯绿皮及绿芽，食品粉碎机打碎，在鼓风干燥箱(<65 ℃)中干燥，干燥后研成粉末状，过50目筛。取10 g马铃薯绿皮粉末于锥形瓶中，加入95%乙醇-乙酸体积比(100∶30/V∶V)(料液比1∶14)，超声功率100%，超声频率45 Hz，超声温度50 ℃，超声波间歇式超声处理2.5 h(每30 min超声波间歇式处理)，用布氏漏斗过滤，残渣重复提取1次，合并收集黄色上清液。旋转蒸发(温度60 ℃)浓缩至浸膏状，瓶中的沉淀用1%硫酸溶解，用布氏漏斗过滤。收集滤液，加入浓氨水调节pH值为10～11，放置于4 ℃冰箱过夜。8 000 r/min，20 min智能冷冻离心，弃去上清液，沉淀用1%氨水洗涤，再离心。如此循环往复，洗涤至洗涤液澄清，离心，沉淀干燥即得粗样。

称取3 mg α-茄碱，加入1%硫酸溶解，移入10 mL容量瓶中，加入1%硫酸溶液至刻度线处，摇匀。此时溶液为0.3 mg/mL标准溶液。分别吸取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL的标准溶液5 mL容量瓶并定容至刻度线，此时溶液质量浓度分别为0.06，0.09，1.20，1.50和1.80 mg/mL。以1%硫酸溶液作为空白。吸取各溶液2 mL，在冰浴中加入5 mL浓硫酸，1 min后加入1%甲醛。待待测溶液冷却之后，选择在波长520 nm处测吸光度，根据不同质量浓度下吸光度值作标准曲线。取粗样2 mg，溶于10 mL 1%硫酸中，分别加入浓硫酸及甲醛，测量吸光度。

1.5 芦荟蒽醌类物质的提取及测定

将新鲜芦荟叶洗净，切成方块，置于粉碎机内粉碎，放入鼓风干燥箱内烘至恒重，取出后冷却至室温，用研钵磨成粉末，过50目筛，即得芦荟粉末。取5 g芦荟粉末于锥形瓶中，加入200 mL 70%乙醇(料液比1∶40)，超声功率100%，超声频率45 Hz，超声温度80 ℃，超声时间90 min。抽滤，得到提取液，旋转蒸发(温度60 ℃)至浸膏状，置于4 ℃冰箱保存。

参见文献[6]方法分析测定芦荟蒽醌类物质，简略步骤为：精密称取105 ℃干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌标准品25 mg，用80%的乙醇溶液溶解，定容至250 mL 容量瓶中，摇匀。精密吸取10 mL，置于25 mL 容量瓶中，再用80%的乙醇溶液稀释至刻度摇匀，得到标准品溶液。分别精密吸取上述标准品溶液1.25，2.50，3.75，5.00，7.50，10.00和12.50 mL置于25 mL容量瓶中，用80%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀。以80%的乙醇溶液为空白，选择在波长225 nm处测吸光度，根据不同质量浓度下吸光度值作线性回归。取芦荟样品提取液1 mL，加80%乙醇稀释至10 mL，测定吸光度。

1.6 混合液的配置

测定两物质提取液质量浓度后，通过计算，取低质量浓度溶液的质量浓度为最终质量浓度，加入生理盐水稀释，1∶1质量浓度配比混合。

1.7 小鼠静脉炎模型的建立

参照文献[7]方法建立小鼠静脉炎模型，5-氟尿嘧啶注射剂量选择300 mg/kg(15 mg/mL)。注射前观察小鼠尾部无破损、无炎症，否则更换动物，常规消毒备皮，微量注射器接4号针头抽取少量生理盐水注射液，于小鼠左侧尾静脉中、远1/3处向近心端穿刺，尽量一次成功，避免针头在组织中探找静脉，针头进入血管后，先注射生理盐水约0.1 mL，确保药物在静脉内无外渗后，保持针头位置不变，将5-氟尿嘧啶慢速推注相应剂量，1～2 min内完成，随后用少量生理盐水冲洗。观察静脉炎症状表现(主要在72 h内出现)。

1.8 实验分组及干预方法

将24只静脉炎小鼠随机分成3组，模型组、硫酸镁组、待测药组，每组8只，另外将正常同类型小鼠设为对照组。模型组：用医用无菌棉浸取生理盐水涂于鼠尾。外敷次数为每天2次，每次2 h，共3 d。硫酸镁组：无菌棉浸取50%硫酸镁溶液覆盖于鼠尾，浸湿的棉布以不滴水为宜，保鲜膜覆盖后用医用透明通气型胶带缠绕并固定。外敷次数为每天2次，每次2 h，共3 d。待测药组：用吸水棉浸取配置好的混合液。处理同硫酸镁组。固定一位置在每日尾静脉给药前和第1次敷药前用游标卡尺测量鼠尾，并观察静脉血管是否发生静脉炎及局部组织有无破溃、变色、瘀斑、脱屑或肿胀等现象。

1.9 评价标准

(1)肉眼观察：按照美国静脉输液护士协会(INS)制订的标准[8]，结合动物实验的特点，去除有关疼痛指标。将静脉炎分为5个等级：0级，没有症状；1级，输液部位发红；2级，输液部位发红、水肿；3级，输液部位发红、水肿，条索状静脉形成；4级，输液部位发红、水肿，条索状静脉形成，有脓液渗出。1级及以上视为发生静脉炎。

(2)肿胀度：用游标卡尺测量鼠尾直径，计算肿胀程度，比较各组肿胀度的差别。肿胀度=[(注射后尾直径-注射前尾直径)/注射前尾直径]×100%。

(3)组织病理学观察：鼠尾静脉及周围组织的损伤判定通过光学显微镜从血管内皮损伤、血管壁增厚、纤维组织增生、血管周围炎细胞浸润、血管周围出血等方面[9]进行观察。

1.10 标本的采集与制作

第3天给药结束后，通过颈椎脱臼法处死小鼠并进行放血处理。从距穿刺点近心端0.5 cm起向尾根部取长约0.8 cm的鼠尾，甲醛固定24 h，脱钙处理之后，制作石蜡切片并进行HE染色。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 马铃薯糖苷生物碱质量浓度测定

根据方法1.4绘制如图1的α-茄碱的标准曲线：y=1.468 8x-0.001 5，R2=0.996 8。取粗样2 mg，溶于10 mL 1%硫酸中，分别加入浓硫酸及甲醛，测量吸光度，计算得马铃薯糖苷生物碱的提取液质量浓度为0.072 4 mg/mL。

图1 α-茄碱的标准曲线Fig.1 Standard curve of α-Solanine

2.2 芦荟蒽醌类物质质量浓度测定

根据方法1.5绘制如图2的1，8-二羟基蒽醌标准品的标准曲线，y=0.005 9x-0.000 2，R2=0.996。取芦荟样品提取液1 mL，加80%乙醇稀释至10 mL，在吸收波长225 nm处测定吸光度。计算得芦荟总蒽醌提取液的质量浓度为0.123 mg/mL。

图2 1，8-二羟基蒽醌标准曲线Fig.2 Standard curve of 1，8-Dihydroxyanthraquinone

2.3 配置混合液质量浓度

取低质量浓度作为最终质量浓度，加定量生理盐水，混合后马铃薯糖苷生物碱及芦荟蒽醌类物质的质量浓度均为0.724 mg/mL。

2.4 静脉炎发生和治愈情况

按照1.9的标准来判断鼠尾静脉炎的发生和治愈情况，推注氟尿嘧啶后小鼠尾血管立即收缩变白、鼠尾明显增粗，皮温降低，伴动物不安挣扎等表现，静脉推注时的阻力随着推注时间的延长而逐渐增加，注射后注射点局部静脉及周围组织变红变硬，鼠尾肿胀变硬，个别出现条索性静脉。药物干预第3天后，模型组动物尾部肿胀明显，注射点局部静脉及周围组织变硬，静脉炎仍达到3级，硫酸镁组鼠尾略有肿胀、发红，炎症属于0～1级，待测药组无明显肿胀和发红(炎症0～1级)，基本恢复正常，说明马铃薯糖苷生物碱和芦荟蒽醌类混合液对5-氟尿嘧啶引起对静脉炎有明显的治疗作用。

2.5 待测药对鼠尾肿胀度影响

各组鼠尾肿胀度见表1，由于对照组没有注射给药，所以其鼠尾肿胀度基本没变化，而模型组鼠尾肿胀度显著加重，与给药前比较，给药后第1天，3组鼠尾肿胀度无显著差异，给予硫酸镁组或待测药湿敷后第2～3天，与模型组比较，两组小鼠鼠尾肿胀度显著减轻，并随治疗时间的延长，肿胀减轻程度越大，其中待测药组的效果更加明显。

表1 各组鼠尾肿胀度比较(%)Table 1 Comparison of rat tail swelling degree of every group(%)

2.6 鼠尾静脉的形态学观察

给药后第3天，镜下观察各组小鼠尾巴病理切片。对照组小鼠无静脉炎发生，鼠尾静脉内皮光整，血管壁无水肿，无炎细胞浸润，见图3(a)；与对照组相比，模型组血管壁明显水肿增厚，有内皮细胞脱落，血管内皮不完整，血管壁全层及周围的结缔组织内可见大量炎细胞浸润，有典型静脉炎症状，见图3(b)；硫酸镁组血管壁也有明显的水肿增厚，其周围可见炎细胞浸润，但其静脉炎症状与模型组相比较轻，见图3(c)；待测药组血管壁无增厚，无内皮细胞脱落，血管壁全层及周围的结缔组织内少量炎细胞浸润，静脉炎症状轻微，见图3(d)。

(a) 对照组；(b) 模型组；(c) 硫酸镁组；(d) 待测药组图3 小鼠尾静脉的形态学(HE，×400)Fig.3 Morphology of mouse tail veins(HE，×400)

3 讨论

化学药物治疗(以下简称化疗)是肿瘤患者最常用的治疗方式之一，静脉输注化疗药物是目前化疗的主要途径。化疗药物的细胞毒性作用和刺激性往往在杀死肿瘤细胞的同时，也会造成组织坏死和静脉炎的发生。静脉炎的发生不仅会增加患者的痛苦，且常常使有序治疗不能如期进行，所以静脉炎的防治工作十分必要。目前我国常规治疗静脉炎的药物有硫酸镁、乙醇等，但其效果并不理想；多磺酸黏多糖治疗静脉炎效果优于硫酸镁，但其提取自动物肝脏，生产成本过高。目前临床中西医结合治疗静脉炎受到许多医务工作者和患者的青睐，临床上常使用植物外敷治疗静脉炎，其中马铃薯和芦荟应用最为广泛，但是其机制尚不清楚，且剂型单一，疗效不稳定，使用不方便[5]。故结合现代中药提取技术研制出使用方便的剂型是未来治疗静脉炎的方向。本实验通过建立提取马铃薯糖苷生物碱及芦荟蒽醌类物质的方法，联合两种提取物质外敷治疗小鼠静脉炎。

5-氟尿嘧啶是广泛用于临床肿瘤治疗的化疗药物，可抑制细胞DNA的合成，且细胞毒性适中[7]，故本实验选用300 mg/kg 5-氟尿嘧啶注射小鼠尾静脉建立静脉炎模型。模型组小鼠尾静脉血管壁明显水肿增厚，血管内皮不完整，血管壁可见大量炎症细胞浸润，提示造模成功。硫酸镁治疗化疗性静脉炎是利用其高渗原理促进局部组织肿胀的消退，且镁离子可以抑制细胞膜上的钙离子通道阻止细胞外的钙离子内流，增强内质网和肌浆网对细胞内钙离子的回收，从而阻止血管平滑肌细胞收缩[10]，减轻血管痉挛，改善微循环。但其抗感染效果不佳，且在实验中发现高质量浓度硫酸镁溶液湿敷极易析出结晶，不利于临床的使用。

马铃薯糖苷生物碱，也称龙葵碱。据《本草正义》记载：“龙葵，可服可敷，以清热通利为用，故治跌仆血瘀”。马铃薯糖苷生物碱主要包括α-茄碱和α-卡茄碱。茄碱因能降低组织的渗透性，抑制透明质酸酶活性，具有抗感染作用；TGA具有抑制真菌、细菌等微生物的作用；拮抗组胺引起的血管扩张和通透性上升，减轻皮肤的红斑渗出。文献[11]报道：糖苷生物碱通过下调兔血清细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和E-选择素(e-selection)含量，改善化疗性静脉炎的病理损伤；另有文献[12]报道，外敷α-茄碱霜膏可有效地控制静脉炎模型兔血清中血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素6(IL-6)的表达。

芦荟为百合科芦荟属植物，味苦、性寒，具有抑菌、杀菌、抗炎、解毒、促进伤口愈合，清除氧自由基等作用。蒽醌类物质是芦荟最主要的生物活性成分，其主要通过直接作用于微生物，如通过抑制细菌的呼吸代谢作用，破坏细胞膜、细胞壁和生物膜，抑制蛋白质和核酸的合成等机制来达到杀灭微生物的效果[13]。有分析提出相比单独使用芦荟，芦荟联合其他常规疗法可以更有效地改善静脉炎的症状[14]。本实验使用超声波法提取出马铃薯糖苷生物碱和芦荟蒽醌类物质的粗品，配置成溶液用于治疗小鼠的静脉炎。选用硫酸镁湿敷为阳性对照，结果证明：该两种物质的混合液比硫酸镁湿敷效果更好，能改善鼠尾静脉炎肿胀度程度和血管内皮损伤、血管壁增厚、纤维组织增生、血管周围炎症细胞浸润等病理表现。但本研究由于条件有限，还存在不足，比如两种提取物的配比和剂型等还需要进一步研究。

综上所述，本实验结果初步得出采用超声提取马铃薯糖苷生物碱和芦荟蒽醌类物质可行，两类物质联合使用能有效预防静脉炎，为进一步研发安全有效的湿敷贴，做了基础探索。