潘毅平，郭苗苗，肖升东，闫鹏先，张国庆，贺 笋

（1.天康生物股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830032；2.天康生物（上海）有限公司，上海 201203）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是一种无囊膜的单股环状DNA 病毒，是最小的DNA病毒之一，目前已发现PCV1、PCV2、PCV3 以及PCV4。PCV1 为非致病性病毒；PCV2 为致病性病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原；PCV4 与水貂圆环病毒的基因组一致性最高（66.9%），与其他PCV 基因组的一致性仅为43.2%～51.5%。据报道[1]，PCV4 检出猪群患有严重临床症状，并有多种病原微生物共感染现象。

2015 年，美国首次报道了PCV3 在猪群中流行[2]。PCV3 病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，其基因组为单股DNA，全长约2 000 bp，包含3 个主要开放阅读框（open reading frame，ORF），主要抗原Cap 蛋白与PCV2 Cap 蛋白基因同源性很低，仅30%左右。2016 年起，我国在多个猪场检测到PCV3。这些猪场无一例外，均出现母猪繁殖障碍、多系统炎症反应和新生仔猪数量急剧下降等问题[3-5]。PCV3 自发现以来，已经逐渐成为影响我国养猪业的重要病原体。目前还没有体外繁殖PCV3 分离株获得成功的报道，这也在一定程度上制约了PCV3 灭活疫苗的研发。

研究人员相继将PCV3 Cap 蛋白在大肠杆菌和杆状病毒/昆虫表达系统中表达并成功组装成病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）[6-8]。但是大肠杆菌表达的PCV Cap 蛋白可溶性低，且有内毒素污染，后期去除内毒素工艺复杂且成本较高；昆虫杆状病毒系统表达的VLP 具有很好的免疫效果，但是昆虫杆状病毒系统表达的Cap 蛋白VLP 产量低、生产成本高、工艺复杂，难以用于动物疫苗的大规模生产及应用推广。酵母表达系统作为一个高效的蛋白表达系统，具有成本低、蛋白可溶性表达等优点。由于PCV3 Cap蛋白自身核定位序列（NLS）的影响，酵母系统直接表达该蛋白时很容易形成不溶性蛋白聚集。本试验通过对PCV3 Cap 蛋白NLS进行改造，在酵母系统完成PCV3 Cap 蛋白的表达、纯化，成功组装PCV3 VLP，以期为进一步研发PCV3 亚单位疫苗奠定基础。

1 材料方法

1.1 菌株与载体

菌株Pichia pastoris X33、载体pPICZαA，均购自Invitrogen 公司。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 离心机，购自HITACHI 公司；恒温摇床，购自上海智诚分析仪器制造有限公司；分光光度计，购自上海美普达仪器有限公司；电转仪，购自BIO-RAD 公司。

1.2.2 主要试剂 YEAST EXTRACT（No.2194133）、tryptone（No.2330844），均购自OXOID 公司；D-sorbitol（No.BCBX1172/MKCF5469）、DTT（No.SLBW1508）、生物素（No.SLBZ4553），均购自Sigma 公 司；HEPES（No.EZ2811E176），购 自BioFROXX 公 司；Zeocin（No.ZEL-40-05），购自invivogen 公司；YNB（No.7332771）购自BD公司；D（+）-无水葡萄糖（No.20180711）、磷酸二氢钾（No.20190225）、磷酸氢二钾（No.20180323）、甲醇（No.20181231）、KOH（No.20180919），均购自沪式公司。

1.3 PCV3 Cap 蛋白一级序列预测及合成

根据NCBI 中PCV3 Cap 蛋白（GenBank 登录号ATD53354.1）序列信息，利用cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp），将PCV3 Cap 蛋白的NLS 进行突变；优化密码子，并在优化核酸序列的5'端添加碱基GCCACC（与起始密码子ATG 共同形成KOZAK 序列），然后送金唯智公司合成。

1.4 重组PCV3 Cap 蛋白表达载体构建与转染准备

将合成的序列用TAKARA 无缝克隆试剂盒，经同源重组的方式整合到pPICZαA 载体酶切位点PstI 和XbaI 之间，获得重组质粒pPICZαAPCV3。随后，把上述重组质粒转化到Top10 感受态细胞中培养。在培养平板上挑取单克隆菌落，抽提质粒并经1%核酸电泳验证、酶切鉴定为阳性后，将线性化的质粒用冷乙醇沉淀方法回收。冷乙醇沉淀的具体操作，参照《分子克隆实验指南》[9]进行。

1.5 酵母表达PCV3 Cap 蛋白与纯化

1.5.1 电转染 将10 µL 线性化质粒和90 µL X33感受态细胞在电转杯中混匀，冰上孵育5 min；然后将电转仪设定为时间恒定模式，电转参数为电压1 200 V、时间5.5 ms、电转杯直径0.1 cm；电击后迅速加入4 ℃遇冷的YPDS 培养基，即获得稳定表达目标蛋白的细胞库；然后将细胞库置于29 ℃恒温培养箱中静置培养3 h；最后将菌液涂布到含有3 mg/mL zeocin 的YPDS 平板上，29 ℃避光静置培养3 d。在此高浓度抗生素筛选出的菌落均是高拷贝菌株。

1.5.2 诱导表达 将上述长出的单菌落转接至含1 mg/mL zeocin 的YPD 平板，然后对PCV3 Cap蛋白菌株进行菌体培养及诱导表达。培养及表达步骤为：挑取酵母单菌落至BMGY 培养基中，250 r/min 29 ℃过夜培养至菌液OD 值为2～6，20 ℃ 3 000 g 离心5 min，抛去上清；用BMM 培养基重悬菌体至菌液OD 值为2 左右，继续放在29 ℃培养箱中震荡培养24 h；然后补加0.5%甲醇，继续29 ℃震荡培养24 h；再次补加0.5%甲醇，同样的条件继续培养24 h。随后离心收集菌体，抛去上清，再用等体积的裂解液（1×protein loading buffer）进行重悬菌体，沸水浴煮沸10 min。随后进行SDS-PAGE 分析，根据SDS-PAGE 结果挑选出表达量最高的菌株。

1.5.3 纯化 用高压冷冻破碎仪裂解细胞，收取上清；然后用20%硫酸铵沉淀目标蛋白，最后用HEPES buffer 重悬。重悬蛋白经过分子排阻层析纯化，获取PCV3 Cap 蛋白。

1.6 PCV3 Cap 蛋白VLP 组装及电镜观察

纯化蛋白在50 mmol/L HEPES、200 mmol/L NaCl、pH7.4 缓冲液中，自组装成大小均一的VLP，负染电镜观察颗粒，用4K CCD 相机获取电镜照片。

2 结果

2.1 PCV3 Cap 蛋白序列优化

参考GenBank ATD53354.1 序列，利用在线工具cNLS Mapper，对PCV3 Cap 蛋白的NLS 序列进行突变。突变后的序列（Opti-Cap）经NLS 预测网站分析发现，不再具有NLS 序列特点（图1）。

图1 优化的PCV3 Cap 蛋白氨基酸序列

2.2 重组PCV3 Cap 蛋白表达载体构建与鉴定

重组质粒pPICZαA-PCV3 经PmeI 酶切后进行1%核酸电泳验证。结果（图2）显示，重组质粒pPICZαA-PCV3 完全线性化。

图2 重组质粒pPICZαA-PCV3 酶切结果

2.3 重组PCV3 Cap 蛋白表达与鉴定

表达PCV3 Cap 蛋白的菌体裂解后进行硫酸铵沉淀及SEC 纯化，将目的蛋白进行12% SDSPAGE 分析，可见大小约27 kDa 的蛋白条带（图3-A）。对目的条带进行MS 分析，鉴定是PCV3 Cap 蛋白。

PCV3 Cap 蛋白经负染制备样品、电镜观察后，用4K CCD 相机获取电镜照片（图3-B），可见均一的颗粒，颗粒直径约18 nm。

图3 PCV3 Cap 蛋白鉴定结果

3 讨论

2015 年，美国初次分离鉴定出PCV3 毒株，随后我国多地发现PCV3 感染[2-5]。PCV3 阳性猪场出现猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、多系统炎症反应等症状。其中：母猪受孕率降低、流产率增加，产木乃伊胎；仔猪主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，致使保育猪体质变弱，容易继发感染。

PCV2 疫苗在我国已应用推广多年，PCV2 疫苗对PCV3 感染能否提供保护尚缺乏足够的证据。由于PCV3 分离株未能实现体外培养，病原学研究尚未深入开展，导致PCV3 的灭活疫苗研发进展受阻。研究人员尝试通过基因工程平台拯救PCV3病毒，并在PK15 细胞上传代成功，这或许会推动PCV3 疫苗的研发进展[10]。根据PCV2 亚单位疫苗研发经验，利用大肠杆菌或细胞直接表达其Cap蛋白制备亚单位疫苗，是一种简单、有效、安全的疫苗生产方式[11-12]。已有研究[7-8]报道，PCV3 VLPs 组装成功，并应用于检测试剂盒研发等。

大肠杆菌表达系统产量高，遗传背景清楚，但是表达产物的内毒素含量高，为产业化生产带来不便；杆状病毒/昆虫细胞表达系统对蛋白的折叠和修饰都较好，但是每次蛋白表达都要控制感染病毒的数量（即感染MOI 与蛋白表达产量有一定的制约关系），且生产工序复杂，因而影响其扩大生产，此外杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产成本也较高。酵母表达系统在研发宫颈癌（HPV）疫苗、人乙肝（HBV）疫苗和人诺如疫苗等方面获得广泛应用。该表达系统具有一定的蛋白修饰功能，而且培养简单、成本低廉，对于兽用生物制品研发、生产有很好的应用前景[13-15]。PCV3 Cap 蛋白的NLS 序列对其蛋白稳定具有重要作用。若完全删除NLS 序列，其在酵母系统中表达极不稳定；保留NLS 序列，则Cap 蛋白在酵母表达系统中易发生不溶性表达。因此，本研究通过突变PCV3 Cap蛋白NLS 区序列，使PCV3 Cap 蛋白在酵母细胞实现可溶性表达，从而为PCV3 Cap 蛋白亚单位疫苗的研发奠定了基础。