赵长润　张文　董志华　陈基明　范文胜　唐宁　韦天超　磨美兰　韦平

要：【目的】明確产蛋鸡源传染性支气管炎病毒（IBV）分离株（GX-YL170808）的结构基因及抗原变异情况，为广西种鸡场的传染性支气管炎（IB）防控提供科学依据。【方法】通过鸡胚尿囊液血凝试验、鸡胚侏儒化试验及3'端非编码区（3'-UTR）测序对分离株进行鉴定;采用RT-PCR扩增S1、E、M和N基因，以MegAlign和MEGA 6.0分别进行核苷酸序列相似性及系统发育进化树分析，运用RDP4和SimPlot对S1、E、M和N基因进行重组分析，利用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0进行糖基化位点预测分析，并通过中和试验进行血清型鉴定。【结果】分离株的鸡胚尿囊液血凝试验呈阴性，鸡胚盲传5代后出现侏儒胚典型病变，其3'-UTR序列与IBV的3'-UTR序列相似性为99.13%;综合病鸡临床症状及其病理变化可确定该病毒为IBV，命名为GX-YL170808。GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因的开放阅读框（ORF）长度分别为1620、327、675和1230 bp，对应编码540、109、225和410个氨基酸残基，与参考株的核苷酸序列相似性分别为60.4%～96.5%、81.8%～97.2%、85.6%～93.5%和85.7%～92.0%;GX-YL170808分离株的S1、M和N基因属于LX4型，而E基因属于LDT3型;4个结构基因内部均无重组区域;除S1基因同时具有N-糖基化和O-糖基化位点外，E、M和N基因均只有N-糖基化位点;S1蛋白裂解位点为HRRRR，与参考株LX4的裂解位点相同。GX-YL170808分离株属于血清4型，不同于常用的疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型），也不同于广西主要侵害雏鸡的IBV优势血清型。【结论】产蛋鸡源IBV分离株并非疫苗株，其基因型和血清型均已发生变异，且该毒株的血清型不同于广西地区侵害雏鸡的优势血清型，提示了广西地区IB防控的严峻性及新型多价疫苗研发的紧迫性。

关键词： 产蛋鸡;传染性支气管炎病毒（IBV）;分离鉴定;结构基因;基因型;血清型

中图分类号： S858.31                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1816-07

Isolation and identification of an infectious bronchitis virus from laying hens and analysis of its genetic variability and serotype

ZHAO Chang-run， ZHANG Wen， DONG Zhi-hua， CHEN Ji-ming， FAN Wen-sheng，TANG Ning， WEI Tian-chao， MO Mei-lan*， WEI Ping*

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】The objective was to identify the structural genes and antigenic variation of infectious bronchitis virus （IBV） isolate GX-YL170808 from laying hens， and to provide scientific basis for the prevention and control of infectious bronchitis （IB） in breeder  farms in Guangxi. 【Method】The virus was identified by hemagglutinin test， chicken embryo dwarf test and gene sequence analysis of the 3' untranslated region（3'-UTR）. The S1， E， M and N genes were amplified by RT-PCR， and the nucleotide sequence similarity and phylogenetic tree analysis were carried out by MegAlign and MEGA 6.0; the recombined analysis of S1， E， M and N genes were conducted by RDP4 and SimPlot; the glycosyla-tion sites prediction analysis were carried out with NetNGlyc 1.0 and NetOGlyc 4.0， and serotype identification was carried out by neutralization test. 【Result】The results showed that the hemagglutination test was negative and dwarf embryo appeared typical lesions after five generations; the similarity between isolate GX-YL170808 and reference IBV strains in 3'-UTR was 99.13%. According to the clinical symptoms and pathological changes of the chickens， the virus was determined as IBV， named GX-YL170808. The open reading frame（ORF） length of S1， E， M and N genes of GX-YL170808 isolate were 1620， 327， 675 and 1230 bp， corresponding to 540， 109， 225 and 410 amino acid residues. The nucleotide sequence similarity between S1， E， M and N genes of GX-YL170808 isolate and reference strain were 60.4%-96.5%， 81.8%-97.2%， 85.6%-93.5% and 85.7%-92.0%. The S1， M and N genes belonged to LX4 type， while E gene belonged to LDT3 type. There was no recombination region in the S1， E， M and N structural genes. The E， M and N genes had only N-glycosylation sites except S1 gene had both N and O-glycosylation sites， and the S1 protein cleavage site of the isolate was HRRRR， which was the same as the reference strain LX4. The GX-YL170808 isolate belonged to serotype 4， which was different from those of vaccine strains H120（serotype 3） and 4/91（serotype 5）， and also different from the dominant serotype of IBV which mainly affected the chicks in Guangxi. 【Conclusion】The IBV isolate GX-YL170808 from laying hens is not vaccine strain， and its genotype and serotype have mutated， and the serotype of this strain is different from the dominant serotype which affects the chicks in Guangxi， suggesting that the severity of IBV prevention and control in Guangxi and the urgency of new multivalent vaccine development.

Key words： laying hens; infectious bronchitis virus（IBV）; isolation and identification; structural gene; genotype; serotype

Foundation item： Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA17204057）; Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA281009）; Guangxi Broiler Industry Innovation Team Construction Special Project of National Modern Agricultural Industrial Technology System（nycytxgxcxtd-19-03）

0 引言

【研究意义】鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害呼吸道、生殖器官和泌尿系统（Cook et al.，2012;Chen et al.，2017;李智超等，2018），其临床症状表现为打喷嚏、气管啰音、咳嗽及产蛋量和鸡蛋品质下降等（Cavanagh，2007;何怡宁等，2016）。IBV基因组极易发生变异，导致新基因型甚至新血清型毒株的出现（周海生等，2017;吴倩倩等，2019），给家禽养殖业带来巨大经济损失。因此，及时准确掌握IBV地方流行株的基因变异和抗原变化，对有效防控IBV感染蔓延及促进养鸡产业持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】IBV为线性单股正链RNA病毒，其基因组全长约27.6 kb（Mo et al.，2013b），具有5'端帽子结构和3'端poly（A）结构，包含5'-cap-Replicase-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-poly（A）-3'至少10个以上开放阅读框（ORF）（Lisowska et al.，2017）。IBV包含4种结构蛋白（Gao et al.，2016），分别为纤突（S）蛋白、小膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。其中，S蛋白在转录后被切割成S1和S2 2个亚蛋白（Jiang et al.，2017），S1蛋白包含3个高度可变区（HVRI、HVRII和HVRIII）。S1蛋白与病毒的免疫原性、组织嗜性、致病性及遗传变异和血清型等密切相关（Belouzard et al.，2012），且S1基因常用于IBV基因分型（Li et al.，2010）。N蛋白在病毒复制、组装及细胞免疫过程中发挥重要作用（Cook et al.，2012）;E蛋白协助病毒完成出芽和病毒样颗粒产生（Li et al.，2010）;M蛋白与N蛋白相互作用而将病毒粒子结合到囊膜上，完成病毒的出芽和装配过程（Feng et al.，2017）。近年来的相关研究表明，除了S1基因极易变异外，M基因、N基因和E基因也出现不同程度的变异（Mo et al.，2013a），且因S1基因重组产生的IBV变异株日趋增多。在英国（Gough et al.，2008）、澳大利亚（Mardani et al.，2010）、韩国（Lim et al.，2015）和美国（Marandino et al.，2016）等国家均新发现有IBV变异株是通过S1基因不同亚群间重组而产生。周海生（2017）研究表明，近年国内分离获得的IBV流行株S1基因组中存在不同程度的点突变和重组现象，疫苗株也频繁参与IBV地方分离株的基因重组。本课题组前期研究发现，广西存在多个流行的IBV基因型和血清型，其中大部分流行株的基因型和血清型均不同于常用疫苗株，且在不同时期存在不同的优势基因型和血清型;虽然大部分广西IBV分离株的结构基因发生不同程度变异，但基因的进化并不完全平行（张丽华等，2016）。近年来，本课题组已从广西各地分离鉴定获得100多株IBV分离株，但主要来源于雏鸡群体（Mo et al.，2013a，2013b）。【本研究切入点】从广西某种鸡场发生产蛋率下降、产软壳蛋等现象的140日龄种鸡群分离获得1株IBV分离株（GX-YL170808），但该分离株与广西目前主要侵害雏鸡的流行株是否相关尚未明确。【拟解决的关键问题】在鸡胚接种试验、RT-PCR和3'端非编码区（3'-UTR）序列分析的基础上，进一步对GX-YL170808分离株的结构基因及血清型进行分析，旨在了解该分离株的结构基因及抗原变异情况，为广西种鸡场的IB防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

广西某种鸡场140日龄种鸡群出现产蛋率下降和产软壳蛋，同时伴有气管啰音，解剖可见气管黏膜出血、输卵管炎症及花斑肾等病变，无菌采取发生病变的气管、输卵管和肾脏等样品。发病鸡群免疫程序为：1、7、9、23和60日龄免疫新支二联苗（IBV H120株），75日龄免疫新支流三联苗（IBV H120株），120日龄免疫新支流法四联苗（IBV H120株）。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;普通鸡胚购自广西富凤农牧有限公司。TRIzol试剂、HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒及2×Taq Master Mix购自北京康维世纪生物科技有限公司;pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞由本课题组制备保存;DMEM培養基购自美国Gibco公司。7种不同的IBV单因子血清（血清型1～血清型7）参照Li等（2012）的方法制备;3'-UTR、S1、E、M和N基因的特异性引物参照Mo等（2013b）的方法进行设计，委托北京华大基因研究中心合成。

1. 2 病毒分离与鉴定

气管、输卵管和肾脏等病料样品与灭菌PBS按1∶3比例充分研磨，反复冻融3次后，12000 r/min离心5 min，取上清液，无菌检测后加入青链霉素（双抗）至终浓度100 U/mL，取0.3 mL上清液接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，37 ℃培养72 h后无菌收集鸡胚尿囊液，以未接种病毒的SPF鸡胚尿囊液为阴性对照，进行血凝试验和3'-UTR序列扩增及测序鉴定;将尿囊液继续盲传5代后观察鸡胚病变。

1. 3 S1、E、M和N基因PCR扩增及测序分析

参照总RNA抽提试剂盒说明抽提鸡胚尿囊液RNA，并采用HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，然后进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收纯化、克隆、转化后提取重组质粒进行PCR鉴定，阳性重组质粒送至北京华大基因研究中心测序。

1. 4 生物信息学分析

测序获得的S1、E、M和N基因序列用MegAlign和MEGA 6.0分别进行核苷酸序列相似性及系统发育进化树分析，参考毒株包括常用疫苗株、国内分离株和国际参考株（Mo et al.，2013a，2013b）。采用RDP4和SimPlot对S1、E、M和N基因进行重组分析;应用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0对S1、E、M和N蛋白进行N-糖基化位点和O-糖基化位点预测分析。

1. 5 血清型鉴定

参照唐宁（2018）的方法制备和培养鸡胚气管环，采用Reed-Muench计算分离株的鸡胚气管环半数感染量（TOC-ID50）。IBV血清分型根据广西大学养禽与禽病学研究所已建立的标准进行鉴定;固定病毒稀释度为200 TOC-ID50稀释各单因子血清，病毒与血清混合作用后，鸡胚气管环组织物出现纤毛且停止运动的最高稀释倍数即为该血清的中和滴度。

2 结果与分析

2. 1 病毒分离及鉴定结果

鸡胚尿囊液血凝试验结果与阴性对照组的结果一致，均未出现血凝现象;但经鸡胚盲传5代后其胚体出现侏儒胚典型病变（图1）。提取鸡胚尿囊液RNA后，采用3'-UTR扩增引物进行RT-PCR鉴定，结果扩增得到约330 bp的目的条带（图2）。测序结果通过NCBI进行BLAST比对分析，发现与IBV的3'-UTR序列相似性为99.13%;综合病鸡临床症状及其病理变化，确定该分离株为IBV，命名为GX-YL170808。

2. 2 分离株S1、E、M和N基因扩增及测序结果

采用特异性引物对GX-YL170808分离株的S1、E、M和N基因进行扩增，结果显示扩增获得的各目的基因片段均与预期结果相符（图3）。测序结果表明，GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因的ORF分别为1620、327、675和1230 bp，对应编码540、109、225和410个氨基酸残基。

2. 3 分离株S1、E、M和N基因核苷酸序列相似性分析结果

MegAlign分析结果显示，GX-YL170808分离株与参考株的S1、E、M、N基因核苷酸序列相似性分别为60.4%～96.5%、81.8%～97.2%、85.6%～93.5%和85.7%～92.0%。与疫苗株H120、LDT3和4/91相比，除N基因仅存在点突变外，GX-YL170808分离株的S1、M和E基因均存在氨基酸插入或缺失现象（表1）。

2. 4 分离株S1、E、M和N基因遗传进化分析结果

由图4可知，在基于S1、M和N基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树上，GX-YL170808分离株均与参考株LX4处于同一分支，即属于LX4型;而在基于E基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树上，GX-YL170808分离株与参考株LDT3处于同一分支，属于LDT3型。

2. 5 分离株S1、E、M和N基因重组及其编码蛋白糖基化位点预测分析结果

采用RDP4分析GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因是否发生重组，并应用SimPlot进行重组结果验证，结果显示4个基因内部均无重组区域。编码蛋白糖基化位点预测分析结果显示，GX-YL170808分离株除S1基因有28个O-糖基化位点外，E、M和N基因均无O-糖基化位点;而S1、E、M和N基因分别有16、3、2和1个N-糖基化位点（图5）。此外，S1蛋白裂解位点为HRRRR，与参考株LX4的裂解位点相同。

2. 6 血清型鉴定结果

Reed-Muench计算结果显示，GX-YL170808分离株的TOC-ID50/mL为10-4.57。在此基础上进行中和试验，并依据中和试验计算相关系数（R<0.25），其判断标准为中和滴度相同或相差1个滴度即属于同一血清型。结果（表2）显示，GX-YL170808分离株与GX-YL1的中和滴度最高，为同一血清型（血清4型），与常用疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型）的血清型均不同。

3 讨论

近年来，由于IBV基因组频繁的点突变、缺失、插入和重组，导致新的变异株不断产生（Li et al.，2013）。在进化过程中，IBV极易发生点突变，尤其是频繁使用弱毒疫苗进行免疫后，极有可能促使野毒株与疫苗株间发生基因重组而形成新的变异株，导致免疫耐受及免疫逃避等现象发生，给养禽业带来巨大经济损失。近年来，广西地区的IBV基因型和血清型均发生明显变异（董志华等，2019），可能是频繁使用疫苗免疫后，IBV受免疫及环境压力双重作用所致（Jackwood and Lee，2017）。本研究从140日龄且出现产蛋率下降和产软壳蛋的种鸡群分离获得1株IBV分离株（GX-YL170808），经病毒增殖、血凝试验、鸡胚侏儒化试验、結构基因序列分析、重组和糖基化位点分析，证实该分离株为IBV变异株，中和试验结果也表明GX-YL170808分离株血清型不同于广西目前主要侵害雏鸡的优势血清型（唐宁，2018）。说明频繁的结构基因变异及血清型改变可能是种鸡群免疫失败的主要原因之一。

为进一步了解GX-YL170808分离株的流行病学特征，本研究对其4个结构基因（S1、E、M和N）进行扩增及重组分析。由于正股RNA病毒依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能，导致IBV极易发生重组（周海生等，2017）。虽然本研究的基因重组分析结果表明4个结构基因内部均无重组区域，但系统发育进化树显示其S1、M和N基因属LX4型，而E基因属LDT3型。已有研究表明，基因重组可广泛发生在IBV基因组的非结构基因等位置（Thor et al.，2011），故不排除GX-YL170808分离株为重组株，且其重组断点在S1、E、M和N基因之外的可能性。因此，下一步需对该分离株进行全基因组测序分析。

本研究还对GX-YL170808分离株进行血清型鉴定，旨在揭示产蛋鸡源IBV分离株的抗原变异特点，结果表明，分离株属于血清4型，不同于常用的疫苗株H120（血清3型）和4/91（血清5型）。血清型是衡量毒株保护性抗原及免疫保护最常用的指标，也是选择疫苗及新型疫苗开发的根据（Li et al.，2012）。GX-YL170808分离株分离自经多次免疫IBV疫苗的产蛋鸡，且该分离株与常用疫苗株的基因型及血清型均不相同，既提示了广西地区IB防控的严峻性，也表明了新型多价疫苗研发的紧迫性。本课题组曾在2004年的广西IBV流行株中鉴定出血清4型毒株（张丽华等，2016），但此后很长一段时间内均未发现血清4型毒株，本研究从140日龄且出现产蛋率下降和产软壳蛋的种鸡群中再次分离获得血清4型IBV流行株（GX-YL170808）。近年来，广西IBV流行株的优势血清型为血清2型，而血清4型是否会成为今后广西IBV流行株的优势血清型，尚需进一步持续跟踪调查。

4 结论

产蛋鸡源IBV分离株并非疫苗株，其基因型和血清型均已发生变异，且该毒株的血清型不同于广西地区侵害雏鸡的优势血清型，提示了广西地区IB防控的严峻性及新型多价疫苗研发的紧迫性。

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（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2019-08-16

基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204057）;广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA281009）;国家现代农业产业技术体系广西肉鸡产业创新团队建设专项（nycytxgxcxtd-19-03）

作者简介：*为通讯作者：磨美兰（1973-），博士，教授，主要从事禽病防治与病原分子生物学研究工作，E-mail：momeilan@163.com;韦平（1962-），博士，教授，主要从事禽病防治与病原分子生物学研究工作，E-mail：pingwei8@126.com。赵长润（1995-），研究方向为预防兽医学，E-mail：zcrun628@163.com