简华锋　祖盘玉　李洪林　牟腾慧　龙广丽　饶永超　林家栋　李辉　张福平

摘要：【目的】揭示刺豚鼠信號蛋白基因（ASIP）SNP位点突变与不同鸡种羽色差异形成机制的关联性，筛选出与鸡种羽色相关的辅助育种分子标记。【方法】参考NCBI已公布的红色原鸡ASIP基因序列（登录号NC_006107.5），运用Primer Premier 5.0设计特异性引物，以罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡为研究对象，通过DNA混合池及PCR直接测序法筛选不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点;估算各SNP位点等位基因频率后，使用RNAfold、NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，探究不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点突变对基因mRNA二级结构、ASIP蛋白翻译后修饰位点及其二、三级结构的影响。【结果】从6个鸡种ASIP基因中检测到7个SNPs位点，分别为Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T。其中，Exon-2-T3203G只出现在罗曼蛋鸡上，Exon-2-G3287A只出现在瑶山鸡上。Exon-2-T168C只出现在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系且位于编码区，该位点突变导致编码氨基酸改变[苏氨酸（Thr）→甲硫氨酸（Met）]，且能导致ASIP基因mRNA二级结构改变，最小自由能增加，稳定性降低。Exon-2-T168C位点突变还导致ASIP蛋白激酶磷酸化位点数量和位置发生改变，但糖基化位点未发生改变;Exon-2-T168C位点突变后ASIP蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角和延伸链的占比增加，而无规则卷曲占比降低，且蛋白三级结构预测结果与二级结构预测结果一致。【结论】在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因上检测到Exon-2-T168C位点，且该位点突变能引起ASIP基因mRNA二级结构、蛋白激酶磷酸化位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变，但并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的内在机制。

关键词： 鸡;羽色;刺豚鼠信号蛋白基因（ASIP）;SNP位点;生物信息学

中图分类号： S831.89                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1823-09

Screening of SNP locus and its bioinformatics analysis of ASIP gene in different chicken breeds with various feather colors

JIAN Hua-feng1，2，3， ZU Pan-yu1，2，3， LI Hong-lin4， MOU Teng-hui1，2，3， LONG Guang-li1，2，3，

RAO Yong-chao1，2，3， LIN Jia-dong1，2， LI Hui1，2， ZHANG Fu-ping1，2，3*

（1College of Animal Science， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in Guizhou， Guiyang  550025， China; 2Institute of Poultry， Guizhou University， Guiyang  550025， China;

3Scientific Research Chicken Farm of Guizhou University， Guiyang  550025， China; 4Guizhou

Agriculture Vocational College， Guiyang  551400， China）

Abstract：【Objective】In order to reveal the association between the agouti signal protein（ASIP） gene SNP mutation and the formation mechanism of the feather color difference in different chicken breeds， and screen out auxiliary breeding molecular markers related to the feather color of chicken breeds. 【Method】According to the ASIP gene sequence of the red rock fowl（accession number NC_006107.5） published by NCBIand design specific primers by Primer Premier 5.0，Roman layer chicken， Taihe silky chicken， Xingyi bantam white feather line， Chishui black-bone chicken， Guizhou yellow chicken and Yaoshan chicken were chosen as research objects. The SNP locus of ASIP gene in different feather color chicken breeds were screened by DNA mixing pool and PCR direct sequencing method;RNAfold， NetPhos 2.0， NetOGlyc 4.0， SOPMA and SWISS-MODEL and other online software were used for bioinformatics analysis after estimating allele frequency of each SNP locus. Analyzing the effect of ASIP gene SNP site mutation in different feather color chickens on gene mRNA secondary structure， ASIP protein post-translational modification site and its secondary and tertiary structure. 【Result】Seven SNPs were detected in ASIP gene from six chicken breeds， they were Exon-2-G17C， Exon-2-T168C， Exon-2-C3032T， Exon-2-T3203G， Exon-2-G3287A， Exon-2-G3313T and Exon-2-C3350T， respectively. Exon-2-T3203G only appeared in Roman layers， and Exon-2-G3287A only appeared in Yaoshan chicken. Exon-2-T168C only appeared in Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line which was located in the coding region of ASIP gene. The mutation led to the change of coding amino acid site[threonine（Thr）→methionine（Met）]， which caused the change of secondary structure of ASIP gene mRNA， increased minimum free energy and decreased stability. Exon-2-T168C site mutation also caused the change of number and location of ASIP protein kinase phosphorylation sites， but the glycosylation sites did not change. The secondary structure of ASIP protein such as the proportions of α-helix， β-turn， and extended chains increased， while the proportion of random coils decreased after Exon-2-T168C site mutated.The prediction result of the protein tertiary structure was consistent with the result of secondary structure. 【Conclusion】Exon-2-T168C locus is detected in the ASIP gene of Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line. Exon-2-T168C locus causes the change of mRNA secondary structure， number of protein kinase phosphorylation sites and positions， and changes the secondary and tertiary structure of ASIP protein.But it is not the internal mechanism that affects the feather color diffe-rence between Guizhou yellow chicken and Xingyi bantam white feather line.

Key words： chicken; feather color; agouti signal protein（ASIP） gene; SNP locus; bioinformatics

Foundation item： Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHZC〔2019〕2285）

0 引言

【研究意义】羽色作为家禽重要的经济性状，可用于家禽品种品系划分及新品种选育。此外，羽色作为重要的遗传标记，不仅可用于家禽品种纯度评价，还可利用伴性遗传的羽色基因进行自别雌雄配套系生产（张健，2019）。目前，针对畜禽毛色或羽色的遗传机制研究主要集中在哺乳动物（敖秋桅等，2015;李英杰等，2015;李隐侠等，2020），包括猪、牛、羊和小鼠等;有关家禽羽色则多以同一品种不同羽色群体为研究对象，探究品种内羽色差异形成机制，但针对不同家禽品种羽色差异的研究鲜见报道。因此，运用分子生物学手段研究不同羽色差异显著鸡种的羽色形成机制，可为地方鸡种的选育和生产实践提供理论指导。【前人研究进展】家禽羽色差异主要是由黑色素的种类不同及分布不均所致（邓素华等，2003）。在哺乳动物及禽类中，黑色素主要分为真黑色素和褐黑色素，而黑色素的合成受多个基因调控，包括黑色素皮质素受体1基因（MC1R）、酪氨酸酶基因（TYR）、小眼畸形相关转录因子（MITF）及刺豚鼠信号蛋白基因（ASIP）等（陈晓燕等，2012;李英杰等，2015）。其中，ASIP基因又称鼠灰色基因（Agouti），由4个外显子和3个内含子组成，第1外显子（Exon-1）为非编码序列且位于ASIP基因5'端非编码区（5'-UTR），而第2、3和4外显子（Exon-2～Exon-4）位于编码区（张静等，2015）。已有研究表明，ASIP基因会抑制MC1R和MITF等基因的表达，促进褐黑素产生，通过改变真黑色素和褐黑色素的比例而影响哺乳动物毛色或禽类羽色（刘晓妮等，2015）。ASIP基因以竞争性抑制结合G蛋白偶联受体及下调MC1R信号水平的方式，促使真黑色素合成转变为褐黑色素合成（刘琳玲等，2011）。此外，ASIP基因通过降低环磷酸腺苷（cAMP）水平来拮抗MSH-MC1R作用信号而下调MITF基因表达（Hida et al.，2009），最终导致褐黑色素合成增加，致使畜禽的毛色由黑色变为黄色或棕红色。ASIP基因作为参与黑色素合成的重要基因，對家禽羽色的形成也具有重要作用。在哺乳动物中，付冬丽等（2013）通过研究ASIP基因在野猪群体里的变异及其与被毛表型间的相关性，结果在3'端非编码区（3'-UTR）发现1个SNP位点，并推测不同毛色的野猪群体是由该突变位点C等位基因所引起;苏咏梅等（2019）研究发现，ASIP基因第3外显子349位点突变可作为鉴别家驴中纯黑色驴和非纯黑色驴的早期选育分子标记。在禽类上，徐莹（2014）研究发现，在朝鲜鹌鹑（栗羽）及其突变系黑羽和白羽群体中，ASIP基因在不同日龄浅色羽朝鲜鹌鹑中的表达量均高于深色羽朝鲜鹌鹑;张静（2015）通过直接测序发现鹅ASIP基因存在SNP位点和插入或缺失突变，且PCR-RFLP分型结果表明A等位基因在皖西白鹅白羽、皖西白鹅花羽、狮头鹅灰羽和狮头鹅白羽4个群体中均占优势;彭思雪（2016）通过分析鸭ASIP基因多态性与羽色性状的关系，发现该基因存在5个SNPs位点，且证实ASIP基因是鸭基因组上的多拷贝基因，但其拷贝数在不同羽色鸭群间差异不显著，因而推测ASIP基因拷贝数与羽色变异不相关;丁颖等（2018）研究表明，在灰羽和白羽2种羽色朗德鹅中，皮肤ASIP基因的表达量在1月龄无显著差异，但至2月龄时白羽ASIP基因的表达量显著高于灰羽。【本研究切入点】至今，针对不同羽色差异显著鸡种ASIP基因SNP位点筛选及其生物信息学分析的研究鲜有报道，不同羽色鸡种ASIP基因是否存在SNP位点差异及SNP位点差异是否导致编码蛋白功能发生改变，最终导致不同鸡种羽色差异的机制也尚未明确。【拟解决的关键问题】参考NCBI已公布的红色原鸡ASIP基因序列设计扩增ASIP基因编码区第2、3和4外显子的特异性引物（由于鸡ASIP基因第1外显子位于非编码区，因此未进行检测），利用DNA混合池结合PCR直接测序法对白羽、黑羽、黄羽和麻羽4种羽色差异显著的罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡等6个鸡种进行ASIP基因SNP位点筛选，并开展生物信息学分析，为揭示ASIP基因SNP位点突变与不同鸡种羽色差异形成机制的关联性提供理论依据，进而筛选出与鸡种羽色相关的辅助育种分子标记。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以6月龄的罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡为研究对象，各150羽，公母各半，所有试验鸡均由贵州大学科研鸡场提供。其中，罗曼蛋鸡为白羽;泰和乌骨鸡为白羽丝毛;兴义矮脚鸡白羽系为白羽;赤水乌骨鸡毛色为黑羽和杂色羽2种，其中母鸡均为黑羽，公鸡少部分带有杂色羽;贵州黄鸡为黄羽;瑶山鸡为麻羽。为研究不同鸡种羽色形成机制，按其羽色分为白羽、黑羽、黄羽和麻羽4个鸡种。本研究选用的试验鸡均为经不同选育且具有显著羽色差异鸡种，其选育程度由高到低依次为罗曼蛋鸡>瑶山鸡>泰和乌骨鸡>赤水乌骨鸡>贵州黄鸡>兴义矮脚鸡白羽系，拟从品种和选育程度2个方面对6个鸡种羽色差异的形成机制进行探究。采用含肝素钠的采血管经翅静脉采血1.5 mL，置于冰盒带回实验室，-20 ℃保存用于后期基因组DNA提取。Ezup柱式动物血液基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖、GoldView核酸染料、DM2000 DNA Marker和2×Taq Master Mix等购自生工生物工程（上海）股份有限公司，双蒸水和TBE电泳液由高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室自备。主要仪器设备：C1000 TouchTM Thermal Cy-cler PCR仪（Bio-Rad公司）;凝胶成像系统（Bio-Rad公司）;DYCZ-24F电泳仪（北京六一仪器厂）;低温高速冷冻离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司）;超微量紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

2. 4. 3 ASIP蛋白二级结构预测结果 使用SOPMA预测鸡ASIP蛋白二级结构，结果（表5和图4）显示，Exon-2-T168C位点突变导致ASIP蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角和延伸鏈的占比增加，而无规则卷曲占比降低。

2. 4. 4 ASIP蛋白三级结构预测结果 利用SWISS-MODEL对鸡ASIP蛋白三级结构进行预测，结果发现与二级结构预测结果一致，Exon-2-T168C位点突变导致ASIP蛋白三级结构发生改变（图5）。

3 讨论

地方鸡品种因其肉质鲜美在家禽市场上具有很大潜力，但其羽色参差不齐极大影响其商品经济效益。从家禽羽色育种中选育出羽色一致的地方鸡品种，是破解地方鸡产业发展瓶颈问题的有效措施，当前常用的选育方法是不断选留羽色一致的种群进行自繁自养，以获得羽色一致的品系，但此法耗时长、投入大且育种效果缓慢。运用分子生物学手段筛选家禽羽色形成相关基因的分子标记可提高育种进程，并提高家禽羽色整齐度，有效缩短育种时间，进而提高经济效益。目前，关于ASIP基因SNP位点的研究主要集中在地方猪（师科荣，2003）、绵羊（付冬丽等，2014）、山羊（王壮志等，2014）、牦牛（张建一等，2014）及家兔（李维等，2016）等哺乳动物被毛毛色表型上，而与家禽羽色相关的研究报道较少。Hiragaki等（2008）研究表明，日本鹌鹑黄色羽和隐性黑羽是由ASIP基因控制，隐性黑羽是由于ASIP基因缺失一段8 bp的序列（CTGTTAAA）所致。于文华（2012）研究发现，鸭ASIP基因缺失一段五碱基序列（AAGGT）能破坏基因第3外显子与第3内含子间的拼接供体位点，而引起ASIP基因外显子跳跃，可能是家鸭暗褐色羽变异的主要原因。本研究以罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡等羽色差异显著的地方鸡品种为试验对象，通过DNA混合池及PCR直接测序法，对不同羽色鸡种ASIP基因进行SNP位点筛选，共检测到7个SNPs位点，分别为Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T。其中，Exon-2-T3203G只出现在罗曼蛋鸡上，Exon-2-G3287A只出现在瑶山鸡上。此外，除Exon-2-T168C位点位于编码区外，其余SNP位点均位于非编码区，与ASIP基因编码区序列在禽类中具有高度保守性（梁正翠等，2011）的研究结果一致。赤水乌骨鸡、泰和乌骨鸡、罗曼蛋鸡和瑶山鸡均是经过世代选育羽色遗传较稳定的品种，而贵州黄鸡是以金黄夏洛克鸡为父本、快大型肉鸡为母本通过级进杂交培育获得;兴义矮脚鸡羽色为黄羽，其白羽系是经过选育的隐性突变纯合系。在本研究中，6个鸡种的羽色均能在其后代中稳定遗传，且不会发生羽色改变，说明显著差异羽色的形成机制可能与ASIP基因多态性无关。

羽色形成受黑色素的影响，而黑色素合成是一个由多基因调控的复杂生化过程。不同禽类羽色差异与其黑色素合成相关基因在皮肤及毛囊组织中的差异表达密切相关（徐莹，2014;陈黎等，2015;丁颖等，2018）。本研究结果表明，虽然在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因第2外显子检测到1个SNP位点（Exon-2-T168C），且该位点突变导致的基因mRNA二级结构及其编码蛋白二、三级结构改变在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系间无明显差异，但两者的羽色存在显著差异，即Exon-2-T168C位点无法解释其羽色差异。由于本研究选用的6个鸡种羽色差异与Exon-2-T168C位点均无关，因此下一步需检测ASIP基因与相关黑色素合成基因在不同羽色鸡种皮肤及毛囊等组织中的表达情况，进而探究ASIP基因的差异表达是否与不同鸡种的羽色差异相符。此外，Exon-2-T168C位点突变能引起ASIP基因mRNA二级结构改变，使其稳定性降低;且该突变属于错义突变，致使编码的Thr突变为Met，导致ASIP基因编码蛋白的磷酸化激酶位点数量和位置均发生改变，引起ASIP蛋白的二、三级结构发生变化。Rieder等（2001）研究表明ASIP基因第2外显子上11 bp的缺失与马的隐性黑毛相关。何晓丹等（2014）研究发现，染色体工程小鼠ASIP基因编码区存在的5个SNPs位点能致使其编码蛋白产生3个错义突变，进而丢失1个β-折叠且蛋白三级结构发生改变，最终导致小鼠的毛色由浅灰色变为深灰色。本研究中，Exon-2-T168C位点突变导致贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因mRNA二级结构、蛋白磷酸激酶位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变，但两者的羽色存在显著差异，因此推测Exon-2-T168C位点突变并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的原因。Exon-2-T168C突变位点是否导致ASIP基因编码蛋白的功能改变尚需进一步研究。

4 结论

在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因上检测到Exon-2-T168C位点，且该位点突变能引起ASIP基因mRNA二级结构、蛋白磷酸激酶位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变，但并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的内在机制。

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（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2020-01-13

基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合支撑〔2019〕2285号）

作者简介：*为通讯作者，张福平（1978-），博士，副教授，主要从事家禽育种研究工作，E-mail：zfu-1010@126.com。简华锋（1997-），研究方向为特种畜禽饲养，E-mail：jianhuafeng@zju.edu.cn