朱 峰, 姚志建, 霍宗利, 吉文亮, 刘华良, 周 庆, 李爱民, 焦 伟, 谷 静*

(1. 江苏省疾病预防控制中心, 南京 210009; 2. 南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023; 3. 江苏国创环保科技有限公司, 南京 211100)

解热镇痛类药物主要分为非甾体类药物和甾体类糖皮质激素类药物,常被用来退热、抗炎、镇痛、抗风湿等[1],例如吡罗昔康能减轻不同关节炎的疼痛以及治疗术后炎症[2]。该类药物不能全部被机体吸收,通过人体排泄的方式以原型药物或代谢药物的形式进入环境水体中,不易降解,且具有较强的生物毒性和富集性[3]。

近年来,解热镇痛类药物的研究多集中于中成药的非法添加[4-7]、兽药的非法添加[8]、茶叶等食品的非法添加[9]以及生物样本[10]的检测,鲜有检测环境水体中解热镇痛类药物的文献报道[11]。美国EPA-1694方法中仅涵盖了一种解热镇痛类药物[12]。环境水体中药物的残留质量浓度很低,一般都在ng/L水平,通常需要通过富集浓缩才满足仪器的检测需求。目前,环境水体中的痕量药物残留通常采用固相萃取法[13-15]、分子印迹法[16]、磁性固相萃取法[17]等进行富集浓缩,其中固相萃取技术的使用最为广泛。该方法不仅富集倍数高,且操作简单、方便,但固相萃取柱价格相对较高。课题组基于前期工作[18],以亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)以及疏水性的二乙烯苯(DVB)作为原料,将NVP、DVB和2-乙基乙烯苯共聚制得一种亲水亲油型的双亲性聚合材料(Guochuang hydrophilic material, GCHM),并将此材料填入装有筛板的SPE管中,从而获得GCHM固相萃取柱,成功用于水体中4种解热镇痛类药物的富集浓缩,不仅成本低且效果好。

目前,解热镇痛类药的检测手段主要有表面增强拉曼光谱法[19]、薄层色谱法[20]、电化学传感器[21]、液相色谱法[2,4,6]、液相色谱-质谱联用法[5,22]。其中液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、定性能力强的特点,因此,更适合于水体中痕量解热镇痛类药物的检测需求。本文建立了环境水体中4种解热镇痛类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱法检测技术,并比较了基于课题组自主研发的固相萃取柱和商业化的固相萃取柱。结果表明,本方法简单方便、成本低、效果好,适合环境水体中痕量水平解热镇痛类药物的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(30A,日本岛津公司),三重四极杆质谱仪(QTRAP 5500,美国AB公司),全自动固相萃取仪(AQUA Trace ASPE799,日本岛津公司), ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美国Waters公司), GCHM固相萃取柱(500 mg, 6 mL,自主研发), Bond Elut Plexa固相萃取柱(500 mg, 6 mL,美国Agilent公司), Oasis HLB固相萃取柱(500 mg, 6 mL,美国Waters公司),有机系微孔滤膜(0.22 μm,津腾公司)。

色谱纯甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)、甲酸(formic acid, FA)购自德国Merck公司,质谱级水购自美国Fisher公司,分析纯盐酸、氨水、乙酸铵(NH4Ac)购自国药集团。对照品:吲哚美辛(Lot. 40121)、美洛昔康(Lot. 40917)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,吡罗昔康(Lot. 232322)、吡罗昔康-D3(Lot. 241931)、美洛昔康-D3(Lot. 252142)购自德国WITEGA公司,苯噻啶(Lot. P552800)购自加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)公司。

对照品溶液:分别称取适量解热镇痛类药物及内标物,用甲醇溶解配成1 g/L的单一标准储备液和单一内标储备液;分别吸取适量单一标准储备液配成1 mg/L的混合标准使用液;分别吸取适量单一内标储备液配成1 mg/L的混合内标使用液。

水样采自上海、江苏、广东,分别选取5个水源水取水点作为采样点,共计15份水样,通过陆路或空运,48 h内冷链运送至实验室分析。

1.2 仪器条件

1.2.1液相条件

分析柱为ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为乙腈。洗脱梯度:0～0.5 min, 95%A; 0.5～2.0 min, 95%A～70%A; 2.0～5.0 min, 70%A～60%A; 5.0～8.0 min, 60%A～20%A; 8.0～10.0 min, 20%A～5%A; 10.0～10.1 min, 5%A～95%A; 10.1～12.0 min, 95%A。柱温箱温度为40 ℃,流速为0.3 mL/min,自动进样器温度为5 ℃,进样体积为5 μL。

1.2.2质谱条件

电离方式:电喷雾离子(ESI)源,正离子扫描;监测方式:多反应监测(MRM)模式;喷雾电压:5.5 kV;离子源温度:550 ℃;气帘气:31.5 L/min;辅助气:6.6 L/min;雾化气:8.4 L/min;各目标物质质谱参数见表1。

1.2.3样品前处理

取500 mL过滤后的水样,用盐酸或氨水调节pH=7.0±0.2,加入10 μL混合内标使用液,混匀,用预先经5 mL甲醇、5 mL水活化过的固相萃取柱富集净化,以20 mL/min的流速上样,待上样结束后,用5.0 mL的纯水洗涤,正压干燥固相萃取柱至近干后,用6.0 mL甲醇洗脱目标物。

洗脱液在40 ℃水浴中用氮气吹至近干,最后用0.5 mL 20%(v/v)的甲醇-水溶液复溶,涡旋混合2 min,过0.22 μm微孔滤膜后,供UPLC-MS/MS测定。

表 1 4种解热镇痛类药物和2种内标化合物的质谱参数

图 1 采用不同流动相体系时4种解热镇痛类药物的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion chromatograms of the four antipyretic analgesics with different mobile phases a. 5 mmol/L NH4Ac-CH3OH; b. 0.1% (v/v) FA-CH3OH ; c. 0.1% (v/v) FA-CH3CN.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

用蠕动泵将配制的单一标准溶液以7 μL/min的流速注入QTRAP 5500质谱仪中,在Q1母离子扫描模式下,比较正离子扫描模式和负离子扫描模式,结果表明各目标物质均在正离子模式下具有更强的响应,且各母离子均为[M+H]+峰。进一步在子离子模式下,通过调节碰撞能,选取各目标物质的最优子离子。以信号最强的子离子作为定量离子,信号次强的子离子作为定性离子,通过优化各离子对的去簇电压和碰撞能,最终确定各目标物质的质谱参数。

2.2 色谱条件的优化

比较了5 mmol/L NH4Ac-水溶液-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇以及0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作为流动相时,各目标物质的分离及响应情况。如图1a、1b所示,当流动相中加入酸后,各目标物质的总体响应强度得到了明显的提高,这主要是因为各目标物质均在正离子模式下进行监测,而酸能提高分析物在正离子模式下的响应强度,因此采用0.1%(v/v)甲酸水溶液作为水相,进一步比较了以甲醇和乙腈作为有机相时各目标物的分离及响应情况。如图1b、1c所示,当使用乙腈作为有机相时,各目标物分离度更好,且响应值与使用甲醇时无明显区别。虽然乙腈的洗脱能力通常要较甲醇强,可能会导致有些物质因出峰快而不能实现基线分离,但在本实验中,使用乙腈不仅缩短了分析时间,而且各目标物具有更好的分离效果。最终本研究选用了0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈作为流动相,4种解热镇痛类药物及2种内标化合物的混合标准溶液的多反应监测色谱见图2。

图 2 4种解热镇痛类药物及2种内标化合物的多反应监测色谱图Fig. 2 Chromatograms of the four antipyretic analgesics and the two internal standard compounds under MRM mode

2.3 固相萃取柱的选择

基于本课题组前期工作[18],合成了一种具有亲水亲脂双亲属性的NDAM-40填料。该填料对水体中的药物及个人护理品具有较好的吸附性能。基于此填料研发了GCHM固相萃取柱,价格约为同类型商业化柱的一半左右。为了评估GCHM固相萃取的性能,与目前应用最为广泛的Waters HLB固相萃取柱和Agilent Bond Elut Plexa固相萃取柱进行了比较。从图3可知,4种目标物质在Waters、Agilent、GCHM固相萃取柱上的绝对回收率(未经内标校正)分别在38.8%～97.6%、47.1%～81.7%、69.6%～102.1%范围内,其中3种分析物在GCHM固相萃取柱上具有更高的绝对回收率,且4种分析物的绝对回收率均高于69.6%。对于PIZ, GCHM的富集效果为Waters HLB的1.8倍。综上所述,本课题组研发的固相萃取柱对于选定的4种解热镇痛类药物具有更好的综合富集效果。

图 3 目标化合物在不同固相萃取柱上的绝对回收率(n=6)Fig. 3 Absolute recoveries of the target compounds on different solid phase extraction columns (n=6) Error bars represent one standard deviation of the six duplicates.

2.4 pH值对萃取效果的影响

图 4 目标化合物在不同pH下的绝对回收率(n=6)Fig. 4 Absolute recoveries of the target compounds with different pH values (n=6)

各目标物质的质子化状态是保留效率和萃取效率的重要参数,由样品的pH值所决定。比较了pH分别为3、7、9时,各目标物质在GCHM固相萃取柱上的富集效果。如图4所示,当pH值为3时,PIZ的绝对回收率仅为32.1%;当pH值为7时,PIZ的绝对回收率提高了一倍多;进一步提高pH值到9时,除PIZ的绝对回收率略有上升(3.3%),其余3种物质的绝对回收率均呈下降趋势。PIZ、PIR、MEL、IND 4种物质的pKa值分别为6.9、6.3、4.1、4.5,介于弱酸性和中性之间。因此,当体系呈碱性时,酸性目标物解离度增大,呈离子化状态,导致其在双亲固相萃取柱上的保留能力减弱,这也解释了当pH值从7增加到9时,PIR、MEL、IND 3种弱酸性物质的绝对回收率降低。而PIZ的pKa接近中性,因此酸性条件或碱性条件都可能会增加其解离度,故而双亲固相萃取柱对其吸附能力降低。综上所述,pH值为7时,4种解热镇痛类药物整体富集效果最佳,故本实验选择在pH值为7时对样品进行富集净化。

2.5 基质效应

基质效应在液相色谱-质谱联用技术中普遍存在,主要是由于共提取物与目标分析物在电喷雾离子源上存在竞争效应,通常以基质抑制效应为主[23,24]。不含目标分析物的空白水样按样品前处理方法处理,获得空白基质溶液,用该基质溶液稀释混合标准使用液,用该基质标准液中各目标物的响应值与纯溶剂稀释所得的同浓度标准液的响应值进行比较,从而评估目标物的基质效应。当基质效应大于100%时,表现为基质增强,反之,则为基质抑制。结果如图5所示,除PIR表现为基质增强效应外,其余3种物质均表现为基质抑制效应。4种物质的基质效应在82.8%～102.2%之间,表明水样经GCHM固相萃取柱净化后,基质去除效果明显,但由于各目标物在过柱时存在绝对损失(见图3),因此为了使定量结果更为准确可靠,本实验采用同位素内标校正法来消除前处理过程中目标物的损失以及基质效应带来的影响。

图 5 目标分析物的基质效应(n=6)Fig. 5 Matrix effect of the target analytes (n=6)

2.6 方法学评价与质量控制

将混合标准使用液用20%(v/v)的甲醇-水配制成1～100 μg/L的系列标准溶液,加入混合内标使用液,使内标质量浓度为10 μg/L。内标法定量时,PIZ与PIR以PIR-D3为内标,MEL与IND以MEL-D3为内标。以目标化合物与相应内标的峰面积比值对质量浓度作标准曲线,4种目标物质的线性相关系数(r)均大于0.995。在空白基质水样中加入较低水平的混合标准使用液,使各目标物质在水样中的质量浓度为10 ng/L,按照优化好的方法进行富集浓缩,将富集浓缩后的样品上UPLC-MS/MS分析,获得各物质的信噪比数据。以3倍信噪比(S/N=3)计算各物质的方法检出限,以10倍信噪比(S/N=10)计算各物质的方法定量限。4种目标物的方法定量限均在1～5 ng/L之间。详细结果见表2。

在不含目标分析物的水样中添加5、20和50 ng/L的标准使用液,加入内标后按照优化好的前处理方法进行样品处理,低、中、高3个加标水平各平行测定6次,考察其回收率及相对标准偏差(RSD)。由表2可见,3个加标水平的平均回收率分别在85.6%～99.0%、91.2%～101.4%、88.9%～106.4%范围内,相对标准偏差分别在2.1%～5.6%、1.4%～5.4%、3.1%～4.5%范围内。

2.7 实际样品检测

对上海、江苏、广东3省市的15份水源水进行了检测。结果仅在一份水样中检测出IND,质量浓度为6.8±0.3 ng/L,表明3省市水源水受4种解热镇痛类药物污染的影响较小。

表 2 4种解热镇痛类药物的方法学参数

3 结论

本研究基于水中有机污染物富集最常用的固相萃取技术,用自主研发的固相萃取填料,建立了SPE-UPLC-MS/MS分析水中4种解热镇痛类药物的方法。该方法简单方便,能满足水体中痕量解热镇痛类药物检测的需求。GCHM固相萃取柱的成本较低,效果也优于两款最具代表性的同类型商品化小柱,预计未来可替代此类价格较高的进口产品,亦能满足水体中其他类似结构或性质的化合物的富集净化,值得推广应用。