陆 丹 池玉梅 高秋芳 赵懿清 吴 皓

［1.江南大学附属医院）三院院区）， 江苏 无锡214000； 2.南京中医药大学， 江苏 南京210046］

虎掌南星又名掌叶半夏，为天南星科半夏属植物掌叶半夏Pinellia pedatisectaSchott 的干燥块茎［1］，具有祛风定惊、降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结的功效［2］，目前尚未被《中国药典》 收载，临床上个大者常代用天南星，个小者常代用半夏，应用较为混乱［3］。迄今，有关天南星科植物的研究大多围绕毒性及炮制机制开展［4⁃8］，鲜有报道虎掌南星质量标准，其物质基础也不明晰。因此，本实验利用HPLC 法研究虎掌南星指纹图谱，以期为该药材质量控制提供依据。

1 材料

Waters Alliance 2695 HPLC，配置Waters 2996 PDA 检测器、Waters Empower Pro 色谱工作站（美国Waters 公司）；KQ⁃500 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯（德国Merck 公司）；水为超纯水（由德国Millipore 纯水器制得）；其他试剂均为分析纯。对照品腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、鸟苷（纯度均大于99.5%，美国Sigma 公司）；夏佛托苷（自制，纯度98.89%）。虎掌南星、天南星、半夏经南京中医药大学谈献和教授鉴定为正品，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 参考文献［9⁃13］，药材粉末过60目筛后精密称定0.6 g，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞并称定质量，超声（40 kHz、250 W）处理45 min，取出放冷，用60% 乙醇补足质量，摇匀，滤过，精密移取续滤液25 mL，蒸干，用2 mL 水复溶，离心并取上清液，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取核苷类成分及夏佛托苷对照品适量，制成0.1 mg／mL 贮备液，精密移取适量，置10 mL量瓶中，加水定容，即得。

2.3 色谱条件 参考文献［10⁃13］。Lichrospher C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（B）（含0.1% 醋 酸），梯度洗脱，程序见 表2；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取样品S5，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下连续进样6 次，以尿苷峰为参照峰，测得15 个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于1%、3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取样品S5，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下每间隔3 h 进样5 次，共12 h，以尿苷峰为参照峰，测得15 个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于1%、3%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取样品S5，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.3” 项条件下进样分析，以尿苷峰为参照峰，测得15 个共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别小于1%、3%，表明该法重复性良好。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 共有峰确定 参考文献［11⁃23］，取样品S1～S10，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，将HPLC 色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）进行分析，生成对照指纹图谱和指纹图谱共有模式，共标定15 个共有峰，见图1～2。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱

图2 HPLC 指纹图谱共有峰

取“2.2” 项下对照品溶液，在“2.3” 项条件下进样，参照课题组前期LC⁃MS／MS 结果，同时比对保留时间与紫外数据，确定6 号峰为腺嘌呤，7 号峰为次黄嘌呤，9号峰为黄嘌呤，10 号峰为尿苷，11 号峰为鸟苷，15 号峰为夏佛托苷，保留时间分别为5.890、6.314、7.543、9.336、15.133、40.548 min。各样品色谱图中均存在10 号峰，其峰面积较大，峰位适中，峰形较佳，而且与相邻峰分离度较好，故选取其作为参照峰（S），见图2，再计算各样品色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，见表3。

表3 10 批样品共有峰相对保留时间及相对峰面积

2.5.2 相似度分析 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）对样品S1～S10 的指纹图谱进行分析，发现相似度均大于0.9，见表4。

表4 10 批样品相似度

2.5.3 模式识别 将相对峰面积数据导入MATLAB7.8，利用欧氏距离对各样品进行聚类分析，结果见图3，可知S5、S7，S3、S9，S1、S10 分别聚为一类，核对表1 显示为同产地药材。以各样品相对峰面积为变量进行特征分析，得到前3 个主成分贡献率分别为61.53%、26.28%、9.50%，累积贡献率达97.31%，表明可以反映样品大部分信息，分别对第一主成分与第二主成分、第一主成分与第三主成分作得分图，结果显示产地相同的样品在主成分得分图上比较接近，与聚类分析一致，见图4～5。

图3 10 批样品聚类分析树状图

图4 第一主成分对第二主成分得分图

图5 第一主成分对第三主成分得分图

2.6 指纹图谱专属性分析 参考文献［24⁃26］，取样品S11、S12，按 “2.1” 项下方 法制备 供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，结果见图6。参照课题组前期研究，将指纹图谱划归为3 块区域，Ⅰ区（0～16 min）含核苷类成分，虎杖南星、天南星、半夏中其组成类似，但含有量存在一定差异，虎掌南星在13 min 未检测到色谱峰；Ⅱ区（16～25 min）半夏峰强度相对较强；Ⅲ区（25～75 min）含黄酮类成分，天南星在该区检测到多种黄酮，半夏检测到夏佛托苷与异夏佛托苷，虎掌南星仅检测到夏佛托苷。

图6 各药材特征图谱

3 讨论

3.1 样品前处理方法选择 课题组前期UPLC⁃ESI⁃Q／TOF⁃MS 测试结果显示虎掌南星中含有核苷及黄酮类成分夏佛托苷，为了同时兼顾两者的提取，选择60%乙醇作为提取溶剂。复溶溶剂比较了0.1%醋酸、水、60%乙醇、甲醇、乙醇，结果显示0.1%醋酸、水作为复溶溶剂时，出峰较多，峰面积较大，由于酸水样品稳定性较差，容易导致样品败坏，最终选择水作为复溶溶剂。

3.2 流动相选择 比较甲醇⁃水、乙腈⁃水体系，结果显示后者体系出峰较多且各色谱峰分离较好；加酸改善峰形，比较乙腈⁃甲酸、乙腈⁃醋酸体系，结果显示，后者可使色谱峰达到基线分离；试验了体系中含0.1%、0.5%、1%醋酸，考察酸用量，结果显示无显著差别，出于对色谱柱的保护，最终选择乙腈⁃水体系（含0.1%醋酸）。

3.3 检测波长选择 利用PDA 进行全波长扫描，比较同一样品不同波长下的色谱图。结果显示，在270 nm 处色谱图出峰较多且基线稳定，因此选择270 nm 作为检测波长。

3.4 色谱柱选择 以乙腈⁃水（含0.1%醋酸）体系为流动相，探讨ACE 5 AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Platisil ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Lichrospher C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Lichrospher C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）等色谱柱对样品的分离效果。结果显示，Lichrospher C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）作用最佳，各色谱峰分离度及峰形较好。

3.5 柱温选择 比较25、30、35 ℃下色谱图的峰形及分离度。结果显示，在25、35 ℃时色谱峰均存在一定程度的漂移，分离效果不佳；在30 ℃时，各色谱峰能较好地分离，并且峰形较佳。

3.6 色谱分析时间选择 记录样品进样后2 h 的色谱图。结果显示，各样品在75 min 后未见色谱峰，表明可在这段时间内出峰完全，故确定分析时间为75 min。

4 结论

本实验建立HPLC 指纹图谱分析虎掌南星所含中等、大极性成分（黄酮和核苷），10 批样品中有15 个共有峰，并且相似度较高。通过与对照品比对色谱峰保留时间及紫外数据，归属了6 个指纹峰，利用基于聚类分析及主成分分析的模式识别法进行分析，发现相同产地的虎掌南星聚为一类，主成分分析结果与聚类分析结果一致；与同科植物天南星及半夏在相同色谱条件下进行指纹图谱比对，发现三者能得到良好区分。综上所述，该方法准确稳定，重复性好，专属性强，可用于虎掌南星的质量控制。