王飞燕 张瑞敏 吴文 朱从一 黄永敬 陈杰忠 曾继吾

摘  要：柑橘黃龙病（Citrus Huanglongbing，简称HLB）是柑橘的毁灭性病害，柑橘感染后不仅导致叶片黄化，影响果实品质，而且会使树势减弱直至植株死亡。本研究以感染黄龙病和健康沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]为材料，对比分析黄龙病树（HLB+）和健康树（HLB）在叶片形态特征、果实品质、矿质元素等方面的差异，旨在掌握黄龙病对沙田柚树体和果实的影响，为促进柑橘黄龙病的防控提供理论参考。沙田柚黄龙病植株与健康植株相比，叶片面积减少28.13%，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别降低40.38%、44.00%和40.47%;果实外观着色异常且果实偏小，平均单果重下降45.62%，果皮变薄，种子败育增多，果实维生素C升高26.44%，达到显著水平，并且不同组织的多个元素发生显著变化。与健康植株相比，黄龙病叶片N和Ca元素分别减少19.00%和49.72%，果肉N元素减少18.00%，而果皮和果肉Ca元素显著升高;病树根、叶片、果皮和果肉S元素均显著低于健康树。病树叶片B和Cu元素分别降低了35.07%和54.45%，果皮Cu元素显著降低了42.96%，果肉Zn元素显著升高了41.30%。黄龙病严重影响了沙田柚叶片形态和果实品质以及矿质元素代谢，应高度重视提高沙田柚果园的黄龙病防控管理水平。

关键词：柑橘黄龙病;沙田柚;色泽;品质;矿质元素

中图分类号：S436.66      文献标识码：A

Abstract： Citrus Huanglongbing （HLB） is a devastating disease that seriously affects the development of citrus industry. It not only leads to leaf yellowing and affects the fruits quality， but also affects the life cycle of citrus trees. In order to investigate the effects of HLB on Shatian pomelo [Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]， the effects of HLB on the leaf morphological characteristics and fruit appearance and internal quality as well as mineral elements of Shatian pomelo were systematically analyzed. The result could provide references for the control of citrus HLB. In this study， the HLB positive Shatian pomelo trees and fruits were used for the experimental group （HLB+） and the HLB negative Shatian pomelo trees and fruits were used as the control group （HLB）. The leaf area， content of chlorophyll a， chloro-phyll b and carotenoid of HLB+ leaf decreased by 28.13%， 40.38%， 44.00% and 40.47%， respectively. The color of the HLB+ fruits was abnormal and the fruits of HLB+ was smaller. The average fruit weight of HLB+ fruits decreased by 45.62%. The HLB+ fruits had thinner peels and its most seeds could not develop normally. The vitamin C content of HLB+ fruits was significantly higher than that of HLB fruits， increased by 26.44%. The content of mineral elements in different tissues changed obviously after infection with HLB. The content of N and Ca of the leaves decreased by 19.00% and 49.72%， respectively， and the content of N of the pulp decreased by 18.00%， but the content of Ca of HLB+ peel and pulp significantly increased compared to the HLB peel and pulp. And the content of S of the HLB+ trees was significantly lower than that of the healthy trees. The content of B and Cu of the HLB+ leaf decreased by 35.07% and 54.45%， respectively. The content of Cu of the HLB+ peel decreased by 42.96% and the content of Zn of the HLB+ pulp increased by 41.30%. HLB seriously affected the leaf morphology， fruit quality and mineral element metabolism of Shatian pomelo trees. So more attention should be paid to the prevention and control of HLB-infected Shatian pomelo.

Keywords： Citrus Huanglongbing; Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu; color; quality; mineral elements

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.018

沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]是芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）的一个栽培品种，是我国柚类著名良种，因其风味独特、营养丰富、耐贮藏等特点而驰名中外，深受消费者喜爱。沙田柚原产广西，现广泛栽培于广西、广东、湖南等省（区），仅广东省梅州沙田柚种植面积超过2万hm2，是当地农业的支柱产业，为经济社会发展做出了重要贡献。由于黄龙病的猖獗蔓延，使得沙田柚的种植面积和产量受到严重影响，阻碍了包括沙田柚在内的柑橘产业的发展[1]。

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing， HLB）是世界范围内柑橘生产的毁灭性病害，由韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）引起，该病原能感染柑橘不同品种，并于1995年正式命名为柑橘黄龙病[2]。该病在柑橘叶片、果实、花、根部、种皮、茎部等部位均显示症状，但症状会因品种不同而有差异[3-5]。黄龙病危害后的叶片出现斑驳黄化、均匀黄化和缺素状黄化3种类型，另外，染病植株容易早期落果，保留的部分果实，品质也发生变化[6]。柑橘果实富含糖类、生物碱类、柠檬苦素类、有机酸、黄酮类、矿物质及维生素类等物质[7-9]。植株的营养水平和色素代谢明显影响果实的品质[10]，沙田柚果实的糖、酸含量和固酸比或糖酸比为沙田柚果实品质的重要指标，沙田柚感染黄龙病后，严重影响果实的外观和内在品质，降低其商品价值，成为制约沙田柚产业发展的重要因素[11-12]。

因此，本研究通过对比分析沙田柚健康和感染黄龙病植株的形态特征、果实品质、矿质元素等方面的差异，具体量化了黄龙病对沙田柚树体和果实的影响，研究结果可为沙田柚果园的管理升级和柑橘黄龙病的防控措施优化提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料为种植于梅州市梅县城东镇的沙田柚成年树，沙田柚无症状植株和黄龙病症状植株均为同一地段。根据沙田柚黄龙病田间典型症状进行识别，对病树外围有枝梢黄化、叶片不对称斑驳黄化、果实不能正常成熟等特征进行取样。无症状植株和黄龙病症状植株各选3株植株，分别标注HLB1、HLB2、HLB3和HLB+1、HLB+2、HLB+3。

1.2  方法

1.2.1  沙田柚病樹黄龙病菌检测  从每株植株外围四方和内堂等5个方位采集30片叶，混合粉碎后进行黄龙病菌检测。采用CTAB法提取DNA[13]。PCR扩增引物为5-GGAGAGGTG?A?GT?-GGAAT TCCGA-3，5-ACCCAACATCTAGGT-AAAAA?CC- 3[14]。扩增体系：Taq mix 12.5 μL;Primer-f 1.0 μL;Primer-r 1.0 μL;DNA模板1.0 μL;H2O 9.5 μL，总体积25.0 μL。扩增程序为94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增带大小约500 bp。根据PCR鉴定结果确定其中的黄龙病阳性植株（HLB+）和健康植株（HLB），并将其用于后续实验。

1.2.2  叶片叶绿素及叶面积测定  根据PCR检测结果确定的黄龙病阳性植株（HLB+）和健康植株（HLB），从每株植株中采集30片叶，分别进行粉碎混合，参照Arnon的方法[15]进行优化，采用乙醇与丙酮等体积浸提法提取叶绿素[16]，并通过Lichtenthaler[17]修正的公式计算3种色素含量。

每株植株随机选取30片鲜叶，并进行恒温烘干至恒重，叶片鲜重与干重差值为叶片含水量。采用扫描仪对每株植株各扫描20片鲜叶，采用Image J 1.51计算叶面积。

1.2.3  沙田柚品质测定  从每株黄龙病阳性植株（HLB+）和健康植株（HLB）各随机选取10个果实，分别测定可溶性固形物、可滴定酸、维生素C、还原糖、蔗糖。用手持折光仪测定果实可溶性固形物含量，采用2，6-二氯靛酚钠滴定法测定维生素C，采用蒽酮法测定果实总糖和蔗糖含量，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖含量[18]，采用碱滴定法测定总酸[19]。

同时从其中选取5个果实，用色差仪（HP- 200）沿果实赤道线取三位点进行果实色差测定，分析黄龙病对沙田柚果实色差的影响。色差采用常用的L*值、a*值、b*值C*以及h0表示。L*值表示表面亮暗，L*值越大则样品表面越亮;a*值表示红绿色差，其正值为红色，负值为绿色;b*值代表黄色与蓝色相比的程度，b*值越大，表明果实黄色越深;h0值表示色泽的色调角，在0°～90°色调角范围内，随着角度的增大，颜色依次从紫红色（0°）、红色、橙红色、橙黄色到黄色（90°）过渡;C*值表示色泽的色饱和度，C*值越大，色泽越鲜艳;h0值在90°～180°范围内，则颜色从黄绿色、绿色到蓝绿色（180°）过渡;而a*/b*值基本能够反映果实的真实色泽[20]。

1.2.4  不同组织中元素的测定  从每株黄龙病阳性植株（HLB+）和健康植株（HLB）中采集根、叶、果皮和果肉。依次分别用清水、洗涤剂、超纯水洗涤3次。烘箱105 ℃杀青0.5 h，80 ℃烘3 h至恒重。粉碎机粉碎后过40目筛子。采用凯氏定氮法[21]和原子吸收方法[22]测定样品的大量元素N、P、K，中量元素Ca、Mg、S以及微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu等11种元素。

1.3  数据处理

采用SAS 9.4软件进行t检验及相关性分析。

2  结果与分析

2.1  沙田柚叶片黄龙病菌检测结果分析

PCR检测结果表明，有明显黄龙病症状的3株植株显示约500 bp电泳带，黄龙病菌呈阳性;而无症状3株植株未显示电泳带而呈阴性（图1），说明供试的有症状植株感染了黄龙病菌，而无症状植株为未感染黄龙病，两种植株可用于后续试验材料。

2.2  黄龙病对沙田柚叶片的影响

通过对HLB和HLB+植株叶片扫描计算叶面积，结果表明，HLB+植株平均叶面积比HLB减小28.13%，呈显著性差异（图2A，表1）。叶片叶绿素和类胡萝卜素测定结果显示，HLB+叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量比HLB分别降低了61.65%、64.79%和57.58%;HLB和HLB+植株的3种色素均呈显著差异;HLB和HLB+叶片含水量分别为58.90%和59.10%，无显著性差异。说明黄龙病可影响沙田柚叶片相关色素的合成或分解代谢，但不影响叶片的含水量，叶片斑驳黄化与含水量无相关性。

2.3  黄龙病对沙田柚果实外观品质的影响

由表2可知，HLB+果实L*值比HLB低12.45%，HLB+果实b*值比HLB低9.87%，L*值和b*值均呈差异显著;HLB+和HBL?植株的果实a*值均为负值，但无显著性差异。HLB+和HLB果实的L*值和b*值呈显著性差异和其外观表型结果一致，说明沙田柚感染黄龙病后，会影响果实亮度和黄蓝色比例导致外观品质不佳。HLB+和HLB果实h0值均在90°～180°范围内，HLB+和HLB果实的a*/b*值分别为-0.41和-0.32，h0值和a*/b*值均无显著性差异。

HLB+和HLB果皮色泽指标相关性分析发现：HLB果皮L*值分别与a*值、a*/b*值呈极显著和显著正相关，a*值与a*/b*值呈显著正相关。而HLB+果皮仅b*值与C值呈显著正相关，其他指标之间无显著性相关（表3）。这在一定程度上说明黄龙病对沙田柚果皮色泽的形成过程产生影响。

2.4  沙田柚感染黄龙病后对果实品质的影响

研究发现，沙田柚感染黄龙病后，果皮厚度比未感染黄龙病的果皮薄了14.37%，呈显著性差异;HLB+果的败育种子数量比HLB显著增多了将近两倍（图2B，表4）;单果重下降了46.03%，呈差异显著（表4）。说明黄龙病可导致沙田柚果皮变薄，提高果实种子败育率，且明显降低单果重。

HLB+和HLB果实品质分析表明，HLB+果实的维生素C含量比HLB升高了26.44%，呈显著性差异;而HLB+和HLB果实的可溶性固形物、可滴定酸、还原糖、蔗糖、糖酸比、固酸比均无显著性差异（表5），说明黄龙病能显著影响沙田柚果实的维生素C代谢。

2.5  黄龙病菌感染对沙田柚不同组织元素含量的影响

2.5.1  黄龙病菌感染对沙田柚不同组织大量和中量元素的影响  对HLB和HLB+植株不同组织的N、P、K、Ca、Mg、S 6种元素进行测定，结果表明，HLB+叶片中N和Ca元素分别比HLB的降低了18.64%和49.72%，达显著性差异，病树叶片N元素降低，田间表现为叶片黄化。HLB+果肉中的N比HLB降低了17.59%，而Ca元素升高了32.92%，两者均呈显著性差异;HLB+果皮中的Ca比HLB升高了37.43%，呈显著性差异。因此，HLB+果实（果皮和果肉）中的Ca高于HLB果实，异于其他组织的元素分布（表6）。

HLB+植株根系、叶片、果皮、果肉中的S分别比HLB降低了32.76%、37.73%、60.47%、53.49%，根據显著性分析，HLB根系、叶片、果皮和果肉中的S均显著高于HLB+。HLB?和HLB+根系、叶片、果皮和果肉中的P、K、Mg元素含量均无显著性差异（表6）。说明黄龙病对沙田柚不同组织的大量和中量元素存在不同程度的影响，其中对N、Ca和S元素的影响较大。

2.5.2  黄龙病菌感染对沙田柚不同组织微量元素的影响  对HLB+和HLB不同组织的Fe、Mn、B、Zn、Cu 5种微量元素进行分析，结果表明，HLB+叶片中B和Cu分别比HLB的降低了34.74%和54.45%，果皮中Cu降低了42.96%，HLB+和HLB植株叶片B、Cu和果皮Cu均呈显著性差异。HLB+果肉Zn比HLB的升高了41.30%，呈显著性差异。Fe和Mn在HLB+和HLB间差异不显著（表7）。

2.5.3  黄龙病对沙田柚叶片特性和果实品质与矿质元素相关性的影响  对HLB和HLB+叶片指标与其11种矿质元素进行相关性分析，结果发现，HLB叶片Zn与类胡萝卜素呈极显著正相关，而Mg与类胡萝卜素呈显著负相关。另外，HLB叶片Fe和K分别与叶片叶面积和含水量呈显著正相关（表8）。由此可知，HLB叶片Zn、Mg、Fe、K元素与叶片特征指标存在显著相关性，而HLB+叶片的11种矿质元素与叶片指标无显著相关性，黄龙病对沙田柚叶片营养和发育存在明显的影响。

通过对HLB和HLB+果实品质指标与其11种矿质元素含量进行相关性分析可知，HLB果实的Mg和Fe与还原糖含量呈显著负相关;HLB+果实中P和Mn与可滴定酸呈显著负相关，而和发育正常种子数呈极显著负相关（表9）。

3  讨论

3.1  黄龙病影响沙田柚叶片组织分化和果实正常发育

据报道，柑橘黄龙病可导致叶片不均匀斑驳黄化或缺锌症状黄化，叶片变小，叶片叶绿素含量降低;果实变小，果皮光滑，无光泽，风味差，且着色不均匀[23-24]。本研究发现黄龙病沙田柚叶片出现黄绿相间的斑驳黄化，叶片比健康树小，且叶绿素和类胡萝卜素含量明显小于健康叶片，与前人报道一致。发现黄龙病果明显偏小，HLB+和HLB的果实亮度和黄蓝色差均存在显著差异。因此，柑橘黄龙病可影响沙田柚果皮的正常着色和叶片特性，其具体机理还需进一步探讨。

柑橘果实的生长发育与水和干物质的积累有重要关系。柑橘受水分缺失胁迫的情况下，果实通常较小，果皮变厚，但随施水量增加，果汁的TSS含量和酸度减少，固酸比和果汁量与施水量存在正相关关系[25]。黄龙病枝条的水运输和物质积累受阻，使果实生长发育包括大小、重量和固酸比均降低，但果实酸度增加。Dagulo等[26]和Raithore等[27]均对比分析了哈姆林甜橙（Hamlin）、瓦伦西亚橙（Valencia）健康果实和具黄龙病症状的果实品质，与健康果实相比，黄龙病果实的TSS减少量、柠檬酸增加量和固酸比的变化相似。Bassanezi等[6]测定了巴西多个感黄龙病甜橙品种的果实品质，大部分品种感染黄龙病后，TSS含量、酸度、固酸比和果汁率等品质指标变化明显。本研究发现黄龙病可显著增加沙田柚果实维生素C含量，而对TSS、TA、还原糖和蔗糖的影响不明显。

据报道，果实的N、K、Cu累积和Ca、Zn下降可导致果实可滴定酸和维生素C含量下降[28]。本研究中，黄龙病果果肉的N、Ca、Zn 3种矿质元素含量与健康果肉相比发生了显著变化，N元素显著降低，而Ca和Zn元素却显著升高，这可能与黄龙病果实维生素C含量显著升高有关。另外，HLB+果皮明显比HLB的薄，HLB果皮厚度与Ca和S元素相关系数为分别为-0.94和0.88，HLB+果皮Ca和S元素分别为显著增加和降低，因此，黄龙病影响果皮矿质元素可能导致HLB+果皮变薄。

3.2  黄龙病影响沙田柚树体元素的含量

柑橘黃龙病植株筛管胼胝质大量积累，出现堵塞，因此，对于营养物质运输形成障碍，影响了营养物质正常流动[29]。同时，元素运输还受病原菌毒素或Fe和Zn螯合物载体的影响[30]。本研究显示，沙田柚HLB和HLB+同种组织的元素存在差异，但在不同组织中的变化趋势不同。N、P、K 3种元素中，HLB和HLB+仅叶片和果肉的N元素呈显著性差异，推测黄龙病对叶片和果肉中的N运输影响更大。Ca元素仅在根部无显著性差异，且HLB+果肉和果皮的Ca元素含量比HLB高，可能在HLB+果实中Ca离子代谢异常，导致Ca离子大量积累，其具体机制有待进一步研究。微量元素对次生代谢活动和细胞结构分化具有重要意义[31]。而HLB+多个组织的B、Zn、Cu元素和HLB均呈显著差异，因此，黄龙病植株各类组织发育异常可能与微量元素有关。

4  结论

沙田柚植株感染黄龙病后，叶片色素代谢和组织发育异常，果实表型等指标发生显著变化，树体和果实营养元素也受到影响。叶片叶绿素等光合色素含量下降，严重影响光合作用，同时不同组织的多个营养元素含量显著变化，对各类组织的形态发生产生重要影响。初步了解黄龙病树的发育和营养分布特性，为进一步研究黄龙病感染植株的异常生理代谢机制及其主要诱因奠定了基础，同时为提高沙田柚果园黄龙病的防控管理水平提供参考依据。

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