范月婷 辛士超 NAYCHIKoko 畅娇 黄天带 黄华孙 华玉伟

摘  要：从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3-羟化酶（F3H）基因序列信息，通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3H基因，分别命名为HbF3H1和HbF3H2。通过荧光定量PCR分析发现，只有HbF3H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3H1所编码的蛋白属于P450超家族，具有保守的F3H结构域，而且HbF3H1基因的启动子中包含多种环境效应元件，说明HbF3H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现，过表达HbF3H1基因的烟草花瓣大量累积花青素，其颜色较非转基因烟草显著加深，同时，荧光定量PCR发现HbF3H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关，说明HbF3H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。

关键词：橡胶树;花青素;类黄酮3-羟化酶;转基因烟草

中图分类号：S794.1      文献标识码：A

Abstract： Based on the transcriptome database of rubber tree （Hevea brasiliensis） leaf tissues， we retrieved the nucleotide sequences of flavonoid 3-hydroxylase （F3H） gene， which is the key enzyme in anthocyanin biosynthesis pathways. Two rubber tree F3H genes， HbF3H1 and HbF3H2 were amplified by RT-PCR. The expression levels of the HbF3H genes were analyzed by quantitative real-time PCR and the expression of HbF3H1 were shown to be completely correlated with the anthocyanin contents in the deffirent developmental stage of leaves and stems. Amino acid sequence analysis results showed that HbF3H1 belonged to the super-family of cytochrome P450， and consisted of typical F3H conserved domains. In the promoter region of HbF3H1 gene， we observed multiple environment response elements， which revealed the possible role of HbF3H1 in environment stress resistance in rubber trees. HbF3H1 was over-expressed in tobacco （Nicotiana tabacum ‘Samsun NN） by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation for further functional verifications. Compared with the wild type control， the petals of transgenic tobacco lines exhibited enhanced red color pigmentation， which was positively correlated with the expression levels of HbF3H1. The results demonstrated that HbF3H1 played an important role in the biosynthesis of anthocyanin. The study would lay a foundation for understanding the anthocyanin biosynthesis pathways in rubber trees.

Keywords： rubber tree; anthocyanin; flavonoid 3-hydroxylase; transgenic tobacco

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.002

花青素屬类黄酮化合物，作为在植物中广泛存在的水溶性天然色素，花青素的积累使花瓣和果实呈现多种颜色来吸引动物进行授粉和种子的传播[1-2]。此外，花青素还具有多种重要的生理功能。在多种生物和非生物胁迫的响应过程中，植物会大量合成花青素并储存于液泡中[3]。花青素的积累能够减少昆虫采食及病原菌侵染[4]。Hoch等[5]研究认为，植物幼枝和幼苗叶片中含有大量合成积累的花青素而呈现红色，主要是为了过滤部分可见光和紫外线，以降低过量光照对植物的胁迫作用。同时，花青素的抗氧化活性有助于清除紫外、干旱和盐胁迫等过程中所产生的活性氧自由基，以减少植物细胞所受到的伤害，从而增强植物的抗性[6-8]。低温冷冻处理诱导芜菁花青素合成酶基因BrANS的表达，促进花青素的合成积累以增强抗冻性[9]。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要工业原材料天然橡胶的主要来源，主要种植于热带和亚热带地区。橡胶树叶片的成熟需要12～20 d，分为古铜期、变色期、淡绿期和成熟期4个阶段。橡胶树易受多种环境胁迫的影响，同时也会合成积累大量花青素而使茎尖和嫩叶呈现古铜色[10-11]。通过分子生物学的方法研究橡胶树中花青素合成相关基因，阐释花青素积累的调控机制，对橡胶树遗传改良具有重要意义。本实验室前期研究表明橡胶树MYB转录因子能够促进花青素的合成积累[12]，然而橡胶树中花青素合成途径中的关键酶基因却并不明确。在植物中，类黄酮3-羟化酶（flavonoid 3-hydroxylase， F3H）是花青素合成过程中的关键酶之一，在决定植物花色、种皮和茎叶着色等性状方面发挥着重要作用，F3H与F35H的比例决定着葡萄果实着色的程度[13]。F3H酶具有广泛的底物特异性，可作用于山萘酚、芹菜素和柚皮素，催化这些中间产物转变为B环-3，4-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素，从而使其具有更强的抗氧化活性[6， 14-16]。

本研究克隆得到2个橡胶树F3H基因的cDNA全长序列，并分析2个基因在橡胶树叶片和嫩茎中的表达模式。对HbF3H基因的序列进行了生物信息学分析，并通过转化烟草验证其生理功能，从而为橡胶树中花青素的合成调控和功能研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

巴西橡胶树‘热研7-33-97种植于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃。取黑暗和正常光照条件下（光照强度3000 lx，周期12 h/d）橡胶树的幼苗嫩茎及古铜期、淡绿期、变色期、稳定期4个时期的叶片，用于橡胶树F3H基因的克隆及表达分析。烟草（Nicotiana tabacum ‘Samsun NN）种子灭菌后，于MS培养基萌发（光照强度4000 lx，周期14 h/d），取8叶龄烟草叶片用于转基因试验。RNA提取试剂盒EasyPure RNA Kit、cDNA第一链的合成试剂盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix及荧光定量PCR试剂盒TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。植物基因组DNA抽提试剂盒Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit及大肠杆菌感受态DH5-α购于生工生物工程（上海）股份有限公司。TA克隆载体pMD-19T、DNA聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase和rTaq Premix购于TaKaRa生物有限公司（日本）。

1.2  方法

1.2.1  橡胶树F3H基因及启动子片段的克隆  依据橡胶树古铜期叶片转录组数据库筛选得到2条橡胶树F3H基因序列，在此基础上设计特异性引物CDS-F3H1和CDS-F3H2，引物序列见表1。提取橡胶树古铜期叶片总RNA，以总RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，获得目标基因片段。HbF3H1启动子的克隆，以橡胶树叶片基因组DNA为模板，使用表1中的proHbF3H1引物进行PCR扩增，最后获得启动子片段。将获得的目标基因片段和启动子片段纯化回收后通过TA克隆构建到pMD 19-T载体上，转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，通过重组单克隆测序获得2个橡胶树F3H基因全长编码框序列和HbF3H1上游启动子序列。

1.2.2  橡胶树F3H基因在橡胶树叶片和嫩茎中的表达分析  在橡胶树中，以HbRH8作为荧光定量PCR的内参基因[17]。使用橡胶树古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个时期的叶片以及光培养和暗培养橡胶树的嫩茎cDNA为模板，使用表1中的定量PCR引物Q-HbF3H1和Q-HbF3H2，在Light Cycler 2.0荧光定量PCR仪（Roche公司）中进行荧光定量PCR反应。荧光定量结果采用2-CT方法分析。

1.2.3  HbF3H1基因及其启动子的序列分析  通过NCBI/blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）对橡胶树HbF3H1基因编码的氨基酸序列进行同源序列查找，同时预测其保守域。利用多序列比对软件DNAMAN进行氨基酸序列比对。通过Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plant-care/html/）对HbF3H1基因启动子片段序列进行分析。

1.2.4  烟草转化及阳性株系的鉴定  使用Sal I和Sma I进行双酶切，将HbF3H1基因CDS构建到pCAMBIA2301载体上，位于2×35S启动子下游，得到过表达载体pCAMBIA2301-HbF3H1（图1），转化到农杆菌GV3101中用于烟草转基因试验。烟草的转化参照Pattanaik等[18]的方法。农杆菌侵染煙草叶盘后，共培养3 d，放置含有卡那霉素的分化培养基上进行愈伤组织的培养和抗性筛选，每2周更换一次培养基，直至长出幼苗。剪取几片叶子进行GUS染色分析。同时，提取转基因烟草基因组作为模板，使用表1中CDS-F3H1引物，对转基因烟草株系进行PCR验证。以转基因烟草的花瓣cDNA为模板，使用表1中Q-HbF3H1引物进行荧光定量PCR，分析转基因烟草花瓣中HbF3H1基因的表达水平。

2  结果与分析

2.1  橡胶树F3H基因的克隆

以橡胶树总RNA反转录后的cDNA为模板，使用表1中F3H的基因克隆引物进行PCR扩增，得到2个与预期大小相一致的目的基因片段，分别将其命名为HbF3H1和HbF3H2（图2）。测序得到该基因开放读码框核苷酸序列，HbF3H1长度为1578 bp，编码525个氨基酸;HbF3H2长度为1566 bp，编码521个氨基酸。

2.2  橡胶树F3H基因的表达分析

橡胶树叶片的发育分为古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个阶段，在这个过程中，叶片颜色由紫红色转变为绿色，古铜期叶片花青素提取液较稳定期的深，而光照培养体胚植株嫩茎花青素提取液较暗培养的深（图3）。同时，在本实验室前期的研究中，已经分别测定了橡胶树古铜期和稳定期叶片、黑暗和光照培养体胚植株嫩茎的花青素含量分别为361.0000、24.8095、40.3045、33.0793 μg/g，不同时期和组织的橡胶树花青素含量测定说明花青素含量与颜色的深浅呈正相关[19-20]。因此，为了探索橡胶树F3H基因在花青素合成中的生理功能，本研究以克隆到的2个橡胶树HbF3H基因序列为模板，设计荧光定量分析引物（表1），通过荧光定量PCR分析了橡胶树叶片以及光照培养和暗培养橡胶树幼苗嫩茎中F3H基因的表达情况。在橡胶树中，从古铜期至稳定期，随着叶片红色逐渐褪去，HbF3H1基因的表达量显著下降（图4）。暗培养条件下的橡胶树幼苗嫩茎呈暗红色，而光照培养条件下的幼苗嫩茎呈绿色，在暗培养条件下橡胶树嫩茎中HbF3H1基因的表达水平显著高于光照培养条件下的橡胶树嫩茎（图4）。结果表明HbF3H1基因在叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的累积趋势较为一致，因此，推断HbF3H1基因为橡胶树花青素合成中的关键因素，可用作后续的序列分析和功能验证。

2.3  HbF3H1基因启动子克隆和序列分析

根据橡胶树基因组数据设计HbF3H1启动子扩增引物proHbF3H1（表1），以橡胶树叶片DNA为模板扩增该基因上游启动子片段，通过测序获得该上游启动子核苷酸序列长2.5 kb（图2）。

通过Plant Care分析HbF3H1基因启动子序列，结果发现该启动子片段中存在大量的光、温度等环境响应元件，这说明HbF3H1基因的表达可能同样受光照、温度等多种环境因素的影响（表2）。

2.4  橡胶树HbF3H蛋白序列比对分析

通过NCBI/blastp和多序列比对软件DNAMAN对橡胶树HbF3H1基因编码的氨基酸序列进行同源序列查找、比对。结果表明，橡胶树HbF3H1蛋白属于P450超家族（图5A），其氨基酸序列与大豆、麻风树、木薯、葡萄和玉米的F3H蛋白具有较高的同源性，且均包含有类黄酮3-羟化酶所必需的膜锚定序列、底物选择和结合位点及与血红素结合位点（图5B）。

2.5  HbF3H1基因在烟草中的功能验证

通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，筛选抗卡那霉素烟草株系，然后取叶片进行GUS染色及基因组PCR验证。转基因烟草叶片GUS染色后变为蓝色（图6A），基因组PCR扩增得到HbF3H1基因目标条带，证实已成功获得多个含HbF3H1基因的转基因烟草株系（图6B）。与野生烟草相比，转基因烟草花瓣组织花色加深（图7A），荧光定量PCR结果表明其花色深浅程度与HbF3H1基因的表达水平呈正相关（图7B），初步確定橡胶树HbF3H1基因的表达可促进烟草花瓣中花青素的合成积累。

3  讨论

花青素是植物中的一种重要次生代谢产物，主要积累在花、叶片和果实等器官中，使其呈现丰富多彩的颜色。此外，花青素还具有抗氧化、抗虫、光保护和渗透调节等多种保护作用[21]。目前，在橡胶树中已鉴定出一个调控花青素合成的R2R3-MYB转录因子基因HbAn1，在烟草中过表达该转录因子能够上调花青素合成中多个关键酶基因的表达[12]。但在橡胶树中的花青素合成相关酶的基因还未有详细报道。本研究从橡胶树中克隆得到2个类黄酮3-羟化酶基因，研究这2个基因的表达模式，并进一步对HbF3H1基因进行了序列分析以及在烟草中的功能验证。不同时期橡胶树叶片以及光照培养和暗培养橡胶树嫩茎中的表达分析表明，HbF3H1基因的表达水平与花青素积累趋势较为一致。通过转化烟草发现，过表达HbF3H1能够促进转基因烟草花瓣中花青素的合成积累而使颜色加深。这证实了HbF3H1基因参与橡胶树花青素合成的生理功能。

氨基酸序列比对结果发现，橡胶树HbF3H1基因属于植物中广泛存在的细胞色素P450超家族。P450超家族蛋白具有广泛的催化活性，主要参与多种代谢途径的生物合成以及催化外源化合物，如除草剂、杀虫剂、污染物等转变为非毒性产物[22]。通过分析橡胶树HbF3H1基因的启动子区发现除了包含大量的光效应元件外，还有缺氧响应元件GC-motif和ARE、低温响应元件LTR和多个热应答元件HSE等多种逆境胁迫应答元件，这表明HbF3H1基因可能参与橡胶树非生物胁迫应答反应。Toda等[23]发现，低温能够促进大豆F3H1基因的表达。在水稻中，OsF3H基因的表达受到光照的诱导[24]。最近研究发现，低温处理能够明显上调蜡梅CpF3'H基因的表达[25]。杭菊CmF3'H基因的表达对淹水胁迫有明显的响应[26]。在植物响应逆境胁迫的过程中，F3H酶催化花青素合成途径中的中间产物，使其具有更强的抗氧化活性，从而高效的清除紫外光等一系列逆境胁迫条件下细胞内产生的活性氧（ROS），减少细胞所受到的伤害，增强抵抗环境胁迫的能力[7-8]。

因此，研究橡胶树中花青素的代谢途径以及胁迫条件下的合成调控的分子机制对于推动橡胶树抗逆分子育种有着重要的意义。同时，花青素作为植物中重要的成色物质，将其作为遗传转化的筛选标记可实现实时活体监测，具有简单便捷、检测成本低廉等特点[27-30]。本研究为橡胶树抗逆转基因育种提供潜在的基因资源，也为橡胶树转基因高效可视化筛选奠定基础。

4  结论

本研究在橡胶树基因组和转录组测序结果的基础上，克隆得到2个橡胶树HbF3H基因。在不同时期橡胶树叶片以及光培养和暗培养嫩茎中，HbF3H1基因的表达水平与花青素累积完全一致。HbF3H1基因所编码的氨基酸及其启动子序列发现，HbF3H1蛋白具有保守的F3H结构域，其启动子序列中包含多种环境效应元件，说明HbF3H1基因可能参与橡胶树对环境胁迫的响应。在烟草中过表达HbF3H1基因能够提高转基因烟草花瓣中的花青素含量，使其花色明显加深。这些结果证明了HbF3H1基因能够参与橡胶树花青素合成的生理功能。

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