蔡文坚，谢春燕，柳文俊，钟棱，曾少群，岳峰

(广东嘉博制药有限公司，广东 清远 511517)

鱼油脂肪乳注射液因其丰富的ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)而具有独特的药理作用，尤其在抗感染、降血脂、抗抑郁、免疫调节以及辅助改善记忆等方面有突出的效果[1-5]。鱼油含有丰富的ω-3PUFAs，极易发生氧化反应，从而导致鱼油变质。开发鱼油脂肪乳需要使用一种安全、有效的抗氧化剂，以避免氧化酸败。

L-抗坏血酸棕榈酸酯是一种高效的氧清除剂和增效剂[6]，被《美国药典》收载作为医药辅料，具有安全性高和营养价值高等特点[7-8]，在油脂抗氧化领域有广泛的应用[9-11]。在开发鱼油脂肪乳制剂时，采用L-抗坏血酸棕榈酸酯作为抗氧化剂，可以获得良好的效果。同时根据国家食品药品审批中心指导原则的要求，药品中的抗氧化剂必需进行检测，并在长期存储过程中检测控制。

目前，文献主要报道的是测定食品、奶粉以及油脂中抗坏血酸棕榈酸酯的检测方法，国内未见测定鱼油脂肪乳注射液中的L-抗坏血酸棕榈酸酯含量的文献报道。本研究拟建立一种测定鱼油脂肪乳注射液中L-抗坏血酸棕榈酸酯含量的HPLC-UV法，为开发脂肪乳剂中L-抗坏血酸棕榈酸酯的检测提供参考数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪；BT125D十万分之一电子分析天平(Sartorius)。

1.2 试药

L-抗坏血酸棕榈酸酯对照品(批号：BCBL 0771V，质量分数：98.9%，Sigma公司)；抗坏血酸对照品(批号：20101101-1，分析纯，广州化学试剂厂)；鱼油脂肪乳注射液(批号：18150401、18150402、18150403，广东嘉博制药有限公司)；甲醇(HPLC级，Sinence公司)；四氢呋喃(HPLC级，Merk公司)；水为纯化水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(100 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相：以KH2PO4溶液-甲醇(体积比25∶75)为流动相A，以四氢呋喃-水(体积比45∶55)为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序(0～30 min，95%A；31～41 min，5%A；42～46 min，100%A)；流速：0.7 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：40 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 流动相A 取KH2PO41.0 g，置1 000 mL量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，取KH2PO4缓冲液250 mL及甲醇750 mL置1 000 mL烧杯中，用磷酸调pH至4.0，滤过并进行超声波脱气。

2.2.2 流动相B 取四氢呋喃450 mL及纯化水550 mL置1 000 mL烧杯中，超声波脱气，即得。

2.2.3 稀释液 精密称取抗坏血酸50 mg，置1 000 mL量瓶中，用甲醇-水(体积比8∶2)溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

2.2.4 对照品溶液 精密称取L-抗坏血酸棕榈酸酯25 mg，置50 mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。精密量取对照品储备液1 mL，置25 mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，制成每1 mL中含0.02 mg的对照品溶液。

2.2.5 缺L-抗坏血酸棕榈酸酯阴性溶液 称取鱼油30 g放置烧杯中，加入蛋黄卵磷脂3.6 g搅拌均匀，得油相，备用。将甘油7.5 g溶于270 mL的水中，得水相。然后将上述油相倒入水相搅拌成乳剂，即得缺L-抗坏血酸棕榈酸酯阴性溶液。

2.2.6 供试品溶液 取供试品原液在N2保护下放置于取样瓶中。

2.3 专属性试验

分别取稀释液(空白溶剂)、缺L-抗坏血酸棕榈酸酯阴性溶液、对照品溶液和供试品溶液，照“2.1”项色谱条件进样分析，结果显示空白溶剂和其他原辅料不干扰L-抗坏血酸棕榈酸酯的测定，色谱图见图1。

ABCD180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200mAUmAUmAUmAUt/min28.00527.536048121620343832364044

2.4 检测限及定量限

取L-抗坏血酸棕榈酸酯对照品溶液逐级稀释至信噪比约为10∶1的浓度为定量限，信噪比约为3∶1的浓度为检测限。L-抗坏血酸棕榈酸酯定量限为8 μg/mL，检测限为2 μg/mL。同时，进样6针定量限浓度样品，峰面积的RSD值为1.7%。

2.5 标准曲线的制备

称取L-抗坏血酸棕榈酸酯对照品适量，精密称定，溶于抗坏血酸溶液中，超声溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为1.022 mg/mL的对照品溶液。精密量取上述溶液0.5、1、2、4、5 mL至10 mL量瓶中，加入抗坏血酸溶液定容至刻度，摇匀，得到系列浓度溶液。分别注入液相色谱仪，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，得到线性方程Y=5 171.4X+11.097，r=0.999 7，表明L-抗坏血酸棕榈酸酯质量浓度在0.050 1～0.501 1 mg/mL范围内与峰面积成良好线性关系。

2.6 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6针，结果测得主峰峰面积RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取本品6份，每份溶液连续进样2次，测得每份供试品溶液的平均质量浓度为0.20 mg/mL，其RSD值为1.0%，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一份供试品溶液，在N2保护下密封于取样瓶，放置2、4、6、8 h后取样注入液相色谱仪，测得峰面积RSD值为1.2%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.9 回收率试验

精密称取L-抗坏血酸棕榈酸酯16、20、24 mg至100 mL量瓶中，在N2保护下加入空白溶液(缺L-抗坏血酸棕榈酸酯处方)充分摇匀溶解并定容，得到相当于供试品溶液80%、100%和120%的3个浓度溶液。取对照品和供试品溶液进样分析，结果测得9份溶液的回收率在99.2%～102.0%之间，平均回收率为99.5%，RSD为1.3%，表明方法准确度良好，见表1。

2.10 耐用性考察

取供试品溶液和对照品溶液进样，柱温变化±5 ℃、流速变化20%、波长变化±5 nm时，结果测得供试品中L-抗坏血酸棕榈酸酯含量的RSD值为0%，表明方法耐用性良好。

2.11 样品测定

取批号为18150401、18150402、18150403的3批鱼油脂肪乳注射液进行检测，结果测得L-抗坏血酸棕榈酸酯平均质量浓度分别为0.211 3、0.210 4、0.217 3 mg/mL(n=3)。

表1 L-抗坏血酸棕榈酸酯的加样回收率试验Table 1 Results of recovery test of L-ascorbgyl palmitate

3 讨论

目前，文献报道的L-抗坏血酸棕榈酸酯检测方法主要有碘量法[12]、硅钼兰分光光度法[13]、2，6-二氯酚靛酚法[14]、薄层色谱法[15]。碘量法操作简单，但鱼油脂肪乳注射液为乳白色混悬液体，影响滴定终点的判断；硅钼兰分光光度法需要的试剂多，操作繁琐，影响结果的重复性；2，6-二氯酚靛酚法简便易行、快速，以目测判断终点，误差较大；薄层色谱法要经过制板、点样、展开、显色等处理，操作较繁琐。有报道选择HPLC-ELSD 法检测抗坏血酸棕榈酸酯[16]。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品。但考虑脂肪乳剂含有的有机物质组分较多，有可能会受到其他组分(如油脂)的干扰。

L-抗坏血酸棕榈酸酯作为脂肪乳剂的抗氧化剂，具有易被氧化的特点。如分析前对乳剂进行分离处理该抗氧化剂容易被氧化，考虑到鱼油脂肪乳中油脂含量较低(约占10%)，制备成纳米乳粒，流动性好，进样后可直接溶于流动相中。直接进样可以满足检测要求，同时也避免处理样品时造成L-抗坏血酸棕榈酸酯氧化。但如直接进样，脂肪乳剂含有一定量的油脂，长期反复进样有使反相柱柱效下降的风险。因此，本方法在主峰出来之后继续使用较高浓度的四氢呋喃对残留在色谱柱中的油脂进行洗脱，可减缓色谱柱柱效下降。同时，L-抗坏血酸棕榈酸酯含有酯结构容易水解，需要注意pH值。

本文建立了测定鱼油脂肪乳注射液中L-抗坏血酸棕榈酸酯含量的HPLC-UV法，该方法操作快捷简便，精密度、重复性、稳定性良好，结果准确可靠，可作为鱼油脂肪乳注射液中L-抗坏血酸棕榈酸酯含量的检查方法。