赖伟娜，欧彩诗，袁敏，何健，李坤平

(广东药科大学 1.药学院； 2.中医药研究院，广东 广州 510006； 3.广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，广东 广州 510006； 4.汤臣倍健股份有限公司，广东 广州 511436)

蜂胶(propolis)是一种成分复杂的天然混合物，由蜜蜂从其蜂巢附近各种植物的茎、叶子、花及树皮裂缝中收集得到的化合物和蜜蜂的唾液酶加工而成的高黏性物质，富含酚酸类和黄酮类等成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝、降脂、抗感染等特性[1-3]。2015年版《中国药典》记载蜂胶有补虚弱、化浊脂、止消渴之功效，主治体虚早衰、高脂血症、消渴[4]。然而，刚采收的蜂胶粗品中含有较大量的蜂蜡、树胶类成分，不宜直接使用，需经过适当的提取纯化[1-2]。传统的蜂胶纯化方法为溶剂萃取法，该方法简单但有机溶剂消耗量大，环保性较差[5]。膜分离法和超临界流体萃取法在蜂胶的加工中也有报道，但这些方法对设备要求高，工艺较复杂[5-6]。大孔树脂吸附分离具有工艺简单、易于再生等优点，广泛用于天然产物的提取纯化。本研究旨在开发一种采用大孔树脂富集纯化蜂胶中活性成分的方法，对相关参数进行优化，并进一步分析在大孔树脂上的吸附行为，以期为后续工艺开发奠定基础。

1 仪器与试药

UV752紫外-可见光分光光度仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

Folin-Ciocalteu 试剂(Sigma公司)；95%乙醇、无水乙醇、甲醇、Na2CO3、NaOH(分析纯，广州化学试剂厂)；没食子酸对照品(质量分数98.2%，批号A0110)和芦丁对照品(质量分数98.7%，批号A0103H)为成都曼斯特科技公司产品。供试蜂胶样品由汤臣倍健股份有限公司提供(批号：180701)。大孔树脂：D101(陕西乐博生化科技有限公司)、LSA-21、LSA-40、LSA-900A、LX-32、LX-60、LX-98和XDA-8G(西安蓝晓科技新材料有限公司)和FPA-98Cl(罗门哈斯公司)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮和总酚酸含量的测定

蜂胶总黄酮和总酚酸含量测定参考课题组前期研究[7]。总黄酮测定以芦丁为对照品，其工作曲线方程为A= 30.17 9C- 0.005 2(r=0.999)，在6.3～25.3 μg/mL范围内，线性关系良好。总酚酸含量测定以没食子酸为对照品，Folin-Ciocalteu法测定，工作曲线方程为A= 90.583C+ 0.053 3(r=0.998)，在3.6～8.4 μg/mL范围内，线性关系良好。

2.2 蜂胶提取液的制备

取-20 ℃预冷的蜂胶，快速粉碎，过筛，备用。取粉碎的蜂胶粉，用60%乙醇(用10% NaOH溶液调至pH 8-9)提取，料液比为1∶20，超声(320 W、40 kHz)提取1 h，静置，滤过，滤液即为待吸附液。

2.3 大孔树脂富集纯化蜂胶总黄酮及总酚酸的工艺研究

2.3.1 树脂的筛选 准确称取9种预处理过的树脂各1.000 g，分别加入“2.2”项待吸附液30 mL，室温静态吸附17 h后测定试液中总黄酮和总酚酸的浓度。根据吸附前后的浓度差，计算9种树脂的总黄酮和总酚酸吸附量(表1)。再将吸附后的树脂滤出，进行解吸附实验。其中，FPA98CL和LX98树脂加入70%甲醇(用2 mol/L HCl调至pH=1)50 mL，其余7种大孔树脂加入95%乙醇50 mL，室温静置解吸17 h，用“2.1”项方法检测解吸附液中总黄酮和总酚酸的含量，计算解吸率(表1)。从表1结果可知，FPA-98Cl和LX98树脂的静态吸附量分别达到了80.72和97.54 mg/g(总黄酮)、91.53 和122.21 mg/g(总酚酸)，但是，FPA-98Cl树脂的解析率达到了78.4%(总黄酮)和73.4%(总酚酸)，而LX98树脂的解析率为56.6%(总黄酮)和49.7%(总酚酸)。综合比较，选取FPA-98Cl树脂进行后续研究。

表1 不同大孔吸附树脂对蜂胶总黄酮和总酚酸的静态吸附量和解吸率

2.3.2 FPA-98Cl树脂最佳吸附浓度的确定 将“2.2”项的待吸附液(浓度为C0)进行适当稀释，得到浓度为1/2C0和1/4C0的蜂胶供试液。再将FPA-98Cl树脂3份(1.000 g)分别加至30 mL浓度为C0、1/2C0和1/4C0的蜂胶试液中，静态吸附17 h后测吸附残液中总黄酮和总酚酸浓度，计算吸附率结果见表2。可见，较低的初始浓度有利于吸附进行，当调节初始浓度为1/4 C0时，FPA-98Cl树脂的吸附率达到了69.8%(总黄酮)和66.0%(总酚酸)，相当于以料液比1∶80提取的蜂胶液。

表2 不同初始浓度对蜂胶总黄酮和总酚酸静态吸附和解吸附的影响

2.3.3 FPA-98Cl树脂解吸附条件 取吸附后的同一批FPA-98Cl树脂9份，每份1.000 g，分别加入甲醇(pH值分别为1、2和3)30 mL、70%甲醇(pH值分别为1、2和3)30 mL和95%乙醇(pH值分别为1、2和3)30 mL，室温，磁力搅拌解吸附3 h后测定总黄酮和总酚酸浓度，计算其解吸率，结果见图1A、1B。可见，甲醇的解吸附效果好于70%甲醇和95%乙醇；且pH 值为3的甲醇，更适合于蜂胶黄酮和酚酸类成分在FPA-98Cl树脂上吸附后的洗脱。

AB50403020100403020100总黄酮解吸率/%总酚酸解吸率/%甲醇70%甲醇95%乙醇甲醇70%甲醇95%乙醇123pH

2.4 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮及总酚酸的静态吸附热力学研究

2.4.1 实验方法 参考常规的大孔树脂吸附热力学实验方法[8-10]，精密称取预处理过的FPA-98Cl树脂2.000 g，分别加入50 mL总黄酮质量浓度分别为0.3、0.6、1.0、1.3、1.6、1.9 mg/mL，总酚酸质量浓度分别为0.3、0.6、1.0、1.4、2.0、2.4 mg/mL的提取液，以120 r/min的转速恒温振荡吸附6 h后，测定吸附残液中总黄酮和总酚酸浓度，并根据公式(1)计算树脂的平衡吸附量(Qe)。

(1)

式中：Qe为树脂对总黄酮/总酚酸的平衡吸附量，mg/g；C0为加入的提取液中总黄酮/总酚酸的初始质量浓度，mg/mL；Ce为吸附平衡时的总黄酮/总酚酸质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；W为大孔树脂的质量，g。

2.4.2 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮和总酚酸的吸附等温线及模型 从图2 的FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮和总酚酸的吸附等温线可见，在相同温度下，FPA-98Cl树脂吸附蜂胶总黄酮和总酚酸的平衡吸附量随着蜂胶平衡浓度的增大而增大；在同一平衡浓度下，蜂胶总黄酮和总酚酸的平衡吸附量在温度为40 ℃的情况下最大，30 ℃和50 ℃次之。

为明确蜂胶中总黄酮和总酚酸浓度与吸附量之间的关系，采用常用于描述溶液中溶质吸附的Freundlich和Langmuir两种模型对蜂胶总黄酮及总酚酸吸附等温线进行拟合，两种模型方程见公式(2)和公式(3)[8-10]。

(2)

(3)

式中：KF为Freundlich模型的吸附常数；n为Freundlich模型的吸附指数；Qm为树脂对蜂胶总黄酮/总酚酸的最大吸附量，mg/g；KL为Langmuir模型的平衡常数。

图2 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮(A)和总酚酸(B)的吸附等温线

将在不同温度下蜂胶总黄酮及总酚酸的吸附等温线数据依照上述模型进行拟合，结果见表3和表4。可见，蜂胶黄酮和酚酸类成分在FPA98CL树脂上的吸附行为，用这两种模型拟合的效果都很好，R2值均大于0.95。但是，蜂胶总黄酮的吸附过程更符合Langmuir吸附等温方程，而Freundlich吸附等温方程则更适合用于描述蜂胶总酚酸的吸附。

表3 蜂胶总黄酮的Freundlich和Langmuir吸附等温线模型参数Table 3 Freundlich and Langmuir adsorption isotherm model parameters of total flavonoids in Propolis.

表4 蜂胶总酚酸的Freundlich和Langmuir吸附等温线模型参数

2.5 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮及总酚酸的静态吸附动力学研究

2.5.1 实验方法 准确称取预处理FPA-98Cl树脂3份(每份各3.000 g)加入90 mL蜂胶提取液，120 r/min恒温振荡吸附，定时取样测定试液中总黄酮和总酚酸的浓度，直至吸附平衡。树脂的吸附量(Qe)与时间(t)的关系如公式(4)[8-10]。

(4)

式中：Qe为t时刻测定的树脂吸附量，mg/g；Ct为t时刻蜂胶总黄酮/总酚酸质量浓度，mg/mL。

2.5.2 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮和总酚酸的静态动力学曲线模型及参数 从图3的FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮及总酚酸的静态吸附曲线可见，随着时间的延长，树脂对蜂胶总黄酮及总酚酸的吸附量逐渐升高，在0～120 min时内快速增加，在120～240 min范围内增长速度减慢，240 min后吸附趋于平缓，总黄酮最大吸附量为31.78 mg/g，总酚酸最大吸附量为13.13 mg/g。

为了考察蜂胶总黄酮及总酚酸在FPA-98Cl树脂上的吸附动力学特征及其吸附机理，采用Lagergren准一级动力学方程、Mckay准二级动力学方程和Weber-Morris颗粒内扩散方程来描述和分析静态吸附过程[8～10]，具体方程如公式(5)-公式(7)所示。

Lagergren准一级动力学方程：

ln (Qe-Qt) = lnQe-k1t

(5)

(6)

Weber-Morris颗粒内扩散方程：Qt=k3t1/2+I

(7)

式中：Qt为t时刻的吸附量，mg/g；Qe为平衡吸附量，mg/g；k1为准一级动力学模型的吸附平衡速率常数，min-1；k2为准二级动力学模型的吸附平衡速率常数，g/(mg·min)；k3、I分别为颗粒内扩散速率常数，mg/(g·min1/2)和常数。

图3 FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮(A)和总酚酸(B )的静态吸附曲线

将上述静态吸附实验结果分别采用上述3个动力学方程进行拟合，得到各个模型的参数和相关系数见表5和表6。可见，蜂胶总黄酮在FPA-98Cl树脂上的吸附动力学规律可采用Weber-Morris颗粒内扩散方程描述，即(R2=0.950)；蜂胶总酚酸在FPA-98Cl树脂上的吸附规律则更适合用Mckay准二级动力学方程来描述，即Qt= 0.485 3t1/2+ 2.074 1(R2=0.965)。上述结果，与常见的总酚酸、总黄酮的大孔树脂吸附热力学和动力学研究报道一致[8-10]。

表5 蜂胶总黄酮树脂吸附动力学模型拟合方程及模型参数Table 5 Adsorption kinetics equations and model parameters of flavonoids in propolis on FPA98CL resin

表6 蜂胶总酚酸树脂吸附动力学模型拟合方程及模型参数Table 6 Adsorption kinetics equations and model parameters of phenolic acids in propolis on FPA98CL resin

3 讨论

本研究通过静态吸附和解吸试验对9种大孔树脂进行筛选，结果显示FPA-98Cl树脂对蜂胶黄酮和酚酸类物质吸附量大，解吸率高，适合用于富集纯化蜂胶中此类物质。并且，当上样料液比为1∶80、洗脱液为pH=3的甲醇时，吸附解吸附效果最好。在对蜂胶中黄酮和酚酸类成成分在FPA-98Cl树脂上的吸附热力学进一步研究时，发现Langmuir吸附等温方程能很好地描述FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮的吸附行为；而对蜂胶总酚酸的吸附行为则更符合Freundlich吸附等温线方程。在对蜂胶中黄酮和酚酸类成成分在FPA-98Cl树脂上的吸附动力学进一步研究时，发现Weber-Morris颗粒内扩散方程能很好地描述FPA-98Cl树脂对蜂胶总黄酮的吸附行为，而对蜂胶总酚酸的吸附行为则更符合Mckay准二级动力学方程。

大孔树脂吸附分离纯化技术在食品、医药和化工等行业应用非常广泛，但吸附树脂的种类繁多，性能各异；对于不同的目标组份，应选择适用的吸附树脂[11-12]。对于蜂胶黄酮和酚酸类化合物而言，D101、AB-8、FL-1、LSA-21等树脂均有相关的文献报道[13-17]。在本研究中筛选到的FPA-98Cl树脂为交联丙烯酸阴离子交换树脂，这与陈健等[18]选用FPA-98CL分离泽漆总黄酮的报道一致。然而，FPA-98Cl树脂对酚酸类和黄酮类等含酚羟基化合物的吸着力较强，常需用酸性的强极性溶剂洗脱。从本文结果来看，洗脱溶剂种类及其pH值对洗脱效果影响较大。另外，由于结构上的差异，黄酮酚酸类成分在FPA-98Cl树脂上的吸附热力学及动力学特征不一样，说明蜂胶中不同成分在同一树脂上的吸附行为存在较大的差异。