赖莎，陈丽丽，叶嘉俊，黄会平，易润青，潘芸芸

(1.广东药科大学附属第一医院，广东 广州 510080； 2.广州市医药职业学校，广东 广州 510000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是最常见的疾病之一，由AS病变引起的脑卒中和冠心病已经成为全世界引起死亡的重要原因，找到更好的治疗方法是目前的迫切需要[1]。血管紧张素(1-7)[angiotensin(1-7)，Ang(1-7)]是肾素-血管紧张素系统的新成员，主要由血管紧张素转化酶-2(ACE 2)分解血管紧张素II(Ang II)生成的一种具有生物活性的肽[2-3]。研究发现，Ang(1-7)可能通过改善血管内皮功能、抑制平滑肌细胞增殖及迁移、降低血脂水平、减轻炎症反应，在AS发生和发展过程中起到重要的保护作用[4]。因此，本研究从抑制血管内皮细胞损伤和凋亡、炎症反应等方面，验证Ang(1-7)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用，为研究药物经Ang(1-7)调节途径抗AS的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(Life Technologies,InvitrogenTM)。

1.2 实验试剂

DMEM培养基(美国Gibco公司);ox-LDL(北京协生生物科技有限公司);胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；Ang(1-7)(美国Sigma公司)；Ang(1-7)抑制剂(A779，美国Sigma公司)；MTT细胞增殖检测试剂盒(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；人血管生成素(Ang)、人内皮型一氧化氮合成酶(NOS3/eNOS)、人肿瘤坏死因子α(TNF-α)、人白介素1β(IL-1β)人白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience)；NO测试盒(南京建成)。

1.3 主要仪器

台式低温高速离心机(Z323K)(德国HERMLE公司，TGL-16G)；水平离心机(上海安亭科学仪器厂，TDL-80-2B)；普通培养箱(日本SANYO公司，XMTD203)；HH-1数显恒温水浴锅(金坛市晨阳电子仪器厂，XMTD203)；Thermo酶标仪(美国Thermo公司，MULTISKAN MK3)；FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司，AMG0002073)。

1.4 方法

1.4.1 HUVECs 培养与处理 HUVECs用含10%(φ) FBS的DMEM培养基的培养瓶，在37 ℃、6%(φ) CO2的恒温培养箱中孵化。倒置显微镜下观察，待培养瓶中细胞生长至覆盖瓶底90%以上时，进行传代，收集原代培养3代以内的HUVEGs，采用适当方法储存。

1.4.2 细胞接种 按照1×106个/mL 的密度，在六孔板上加入HUVECs细胞悬浮液，每个孔中补充完全培养液至2 mL，轻轻晃动六孔板混匀细胞悬液，并置于细胞培养箱中培养，待细胞密度达90%以上时，即可加药干预并分组。

1.4.3 实验分组 细胞分为：对照组(HUVECs+PBS)、模型组(HUVECs+100 μg/mL ox-LDL)、Ang(1-7)组[HUVECs+100 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L Ang(1-7)]、A779组(HUVECs+100 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L A779)。

1.4.4 细胞存活率的检测 各组细胞悬液移植到96孔板，每孔0.09 mL，加入0.02 mL MTT试剂(5 mg/mL)，37 ℃培养箱中培养4 h。吸出各孔液体加入0.2 mL DMSO，摇床震荡10 min，于490 nm 波长处读取其吸光度(A)。根据公式：细胞存活率=(实验组A490-空白组A490)/(对照组A490-空白组A490)×100%，计算各组细胞存活率。

1.4.5 细胞凋亡的检测 各组细胞悬液移植到六孔板，于室温下避光加入Annexin V-FITC，染色10 min，同样避光条件下再加入PI染色5 min，双染色后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4.6 血管内皮因子、炎症因子水平的检测 加待测样品0.1 mL于反应孔中，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度(A)值，检测各组Ang(1-7)、eNOS、NO、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组HUVECs的细胞存活率

与对照组细胞存活率(99.98±4.27)%比较，ox-LDL诱导的HUVECs模型组细胞存活率(38.75±2.34)%明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，Ang(1-7)组细胞存活率(68.36±3.30)%显著升高；而与Ang(1-7)组相比，A779组细胞存活率(40.62±2.63)%显著下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

150100500细胞存活率/%对照组模型组Ang(1-7)组A779组***#

2.2 各组细胞凋亡率

与对照组细胞凋亡率(8.10±3.27)%比较，ox-LDL诱导的HUVECs模型组细胞凋亡率(33.20±3.32)%明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，Ang(1-7)组细胞平均凋亡率(24.10±3.97)%显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；而与Ang(1-7)组相比，A779组细胞平均凋亡率(40.60±4.18)%显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

***#细胞凋亡率/%50403020100对照组模型组Ang(1-7)组A779组

2.3 各组Ang(1-7)、血管内皮因子NO、eNOS水平

如表1所示，与对照组比较，ox-LDL诱导的HUVECs模型组Ang(1-7)、NO、eNOS水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，Ang(1-7)组Ang(1-7)、NO、eNOS水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；而与Ang(1-7)组相比，A779组显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1 HUVECs的Ang(1-7)、NO、eNOS水平

2.4 各组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平

如表2所示，与对照组比较，ox-LDL诱导的HUVECs模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，Ang(1-7)组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；而与Ang(1-7)组相比，A779组显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表2 HUVECs的TNF-α、IL-1β、IL-6水平

与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：**P<0.05；与Ang(1-7)组比较：#P<0.05。

3 讨论

AS作为一种常见疾病，可以在人体内存储多年，却无任何病态显现，然后会引起突发性局部组织缺血、心绞痛、心肌梗死、中风或心力衰竭等症状[5-7]，严重影响人类的健康，已成为死亡的主要原因之一[1]。Ang(1-7)是由Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro组成的一种具有生物活性的肽[2-3]，在多种病理生理过程中拮抗Ang II，对于RAS系统过度激活所导致的病变起保护作用，如高血压、心力衰竭和AS等[8-12]。

内皮功能失调是AS发生的重要机制之一，包括NO合成明显减少、内皮源性血管舒张和收缩因子失衡。血管内皮细胞不仅是Ang(1-7)的产生部位，还是其作用的主要靶点。研究发现，Ang(1-7)具有内皮依赖性血管舒张活性，通过与VEC结合刺激NO、缓激肽或内皮舒张因子产生[13-15]。本研究结果证实，在ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中，Ang(1-7)可通过调节内皮型eNOS活化，诱导NO释放，发挥调节内皮功能，保护动脉粥样硬化损伤，并且这些作用能被Ang(1-7)的特异性拮抗剂(A779)全部阻断。

自Ross[16]提出AS是一种慢性炎症性疾病之后，炎症在AS发生发展中的作用逐渐得到公认。TNF-α、IL-1β、IL-6均是参与局部动脉斑块和外周血循环的炎症标志物，参与调控细胞的存活、增殖、死亡等多种功能[17-18]。本研究结果显示，Ang(1-7)可拮抗ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，减少细胞凋亡，发挥了抑制炎症的作用，而这种作用能被Ang(1-7)的特异性拮抗剂A779阻断。

综上所述，本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，分别用Ang(1-7)、A779进行干预，观察过表达和阻断Ang(1-7)后各组细胞存活和凋亡情况，Ang(1-7)的含量，NO、eNOS水平，以及相关炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。结果表明，Ang(1-7)可调节eNOS活化，诱导NO释放，并减少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放，明显降低ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡和损伤的作用，具有抗AS的作用。