★ 吴丽（乐山市食品药品检验检测中心 四川 乐山 614000）

九气拈痛丸具有理气、活血、止痛等功效，用于气滞血瘀导致的胸胁胀满疼痛、痛经。有研究显示采用耳穴贴压法配合口服力气拈痛丸治疗气滞血瘀型原发性痛经疗效显著［1］。九气拈痛丸配方药材包括醋香附、木香、高良姜、陈皮、郁金、醋莪术、醋延胡索、槟榔、甘草、五灵脂等十种中药材。现代中药质量标准强调多组分、多靶点的质量控制［2-3］，而九气拈痛丸现行标准［4］含量测定仅采用HPLC法控制陈皮苷含量，质量控制指标单一。加之当前市场上中药材质量参差不齐，控制多药材中药制剂质量显得很有必要。为增加九气拈痛丸质量控制内容，参阅现行质量标准和相关文献，本文选取配方中占比较大的高良姜和醋香附为质量控制对象，以高良姜素［5］和α-香附酮［6］为目标成分，采用常规C18柱，简单二元流动相等度洗脱，超声提取的方式，建立了高效液相色谱法测定九气拈痛丸中α-香附酮和高良姜素含量的质量控制方法，为有效快速控制九气拈痛丸质量提供了参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器（美国）；XS205梅特勒-托利多电子天平（瑞士）；CQ-100B超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；ULPZY-250DROMB优普系列纯水设备（成都超纯科技有限公司）；ULUP-II-10T优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

α-香附酮（批号：110748-201513，99.7%，中国食品药品检定研究院）；高良姜素（Lot：DST170215-020，≥99%，成都德思特生物技术有限公司）；九气拈痛丸（市售，颈复康药业集团赤峰丹龙药业有限公司，批号1808048和1808053；北京同仁堂制药有限公司，批号17082149；石药控股集团河北永丰药业有限公司，批号11618100314）。甲醇为色谱纯和分析纯，磷酸为分析纯，试验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XTerra®C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；以甲醇-0.05%磷酸溶液（67∶33）为流动相；检测波长：249 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。对照品溶液、供试品溶液和阴性空白溶液的色谱图见图1，α-香附酮、高良姜素峰与相邻峰分离度符合要求。

图1 高效液相色谱图

2.2 对照品溶液制备 取α-香附酮对照品11.15 mg和高良姜素对照品10.90 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备溶液；精密吸取混合对照品贮备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉碎均匀，取粉末约6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40kHz）60 min，放冷，再称定重量，甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的配制 按处方配制不含香附和高良姜的阴性样品溶液。

2.5 定量限试验 分别精密称取α-香附酮和高良姜素对照品，加甲醇溶解，并稀释制成系列浓度溶液，按“2.1”方法进样分析。根据信噪比（S/N）=10，得两组分定量限分别为0.14 μg/mL和0.21 μg/mL。

2.6 线性与范围考察 分别精密吸取“2.2”混合对照品溶液1 mL、2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性系列浓度溶液1；分别精密量取“2.2”混合对照品贮备溶液2、4、8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性系列浓度溶液2；精密量取线性系列浓度溶液1、对照品溶液和线性系列浓度溶液2共6个溶液各10 μL，照“2.1”色谱条件测定峰面积。分别以两组分浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：α-香附酮Y= 33.774X+3.344，（r =0.9999，n=6），范 围2.22～177.84 μg/mL；高良姜素Y= 24.746X- 2.825（r=1.0000，n=6），范围 2.18～174.40 μg/mL。

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果：α-香附酮RSD（n=6）为0.8%，高良姜素RSD（n=6）为0.7%，显示精密度良好。

2.8 重复性试验 取批号为“1808048”的九气拈痛丸样品，照“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果：α-香附酮和高良姜素的质量分数分别为0.1369 mg/g和0.1403 mg/g，RSD（n=6）分别为1.5%和1.8%，显示重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取6份已知含量的样品（批号1808048，测得α-香附酮和高良姜素的含量分别为0.1367 mg/g和0.1402 mg/g）约3g，精密称定，分别精密加入“2.2”项下混合对照品贮备液2 mL，再按“2.3”项下方法制备，精密吸取以上6种溶液各10 μL进样测定，计算加样回收率，结果见表1，表明加样回收率良好。

2.10 稳定性试验 取“1808048”批样品，按“2.3”项下方法处理，室温条件下分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，记录峰面积。结果：α-香附酮RSD（n=7）为0.5%，高良姜素RSD（n=7）为0.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.11 含量测定 分别取4批九气拈痛丸，照“2.3”项下方法制备样品溶液，每批平行制备3份，照“2.1”项下色谱条件测定，采用外标法计算，结果见表2。

3 讨论

根据高良姜素和α-香附酮的紫外光谱图进行分析，高良姜素在249nm波长处为波谷；α-香附酮在249nm波长处为波峰，波峰和波谷处曲线平缓，适用于作为测定波长，选择249 nm波长较为合适。

本实验采用HPLC法快速测定九气拈痛丸中α-香附酮和高良姜素的含量，实验中采用常规的C18色谱柱，直接通过超声提取，过程简单，色谱分析时间短。通过方法学验证，方法专属性高、精密度好、准确度高、简单快速，可作为快速测定九气拈痛丸中α-香附酮和高良姜素含量的方法。实验中，收集三个厂家共4个批次样品进行分析，α-香附酮的含量为0.128 7～0.284 4 mg/g，高良姜素的含量为0.140 2～0.228 3 mg/g，同一个厂家样品间高良姜素和α-香附酮的质量较稳定，不同厂家间质量差异较大，可能与药材种类、生产地环境等多种因素相关［7］，对于制定九气拈痛丸中高良姜素和α-香附酮的含量控制限度，样本量远远不够，可考虑收集更多的样本，制定九气拈痛丸的质量标准。

表1 回收率试验结果

表2 样品含量测定结果